戊型肝炎病毒IgA抗体的研究进展

作者：周越球　陆松尧　梁立敏

【摘要】  戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的经消化道传播的急性传染病，发病率逐年升高，目前尚无特效治疗方法，也无特异性被动和主动免疫制剂可供预防。在急性戊型肝炎患者中，血液或粪便中HEV RNA持续时间较短，操作复杂、成本高，不能在临床广泛开展。HE的诊断主要依靠血清HEV抗体检测，抗-HEV IgM是HE急性感染的诊断指标之一，类风湿因子等的存在会影响血清IgM的检测，造成假阳性。抗-HEV IgG一般在发病2周后可检测到，可持续1年甚至数年，因此抗-HEV IgG不能鉴别患者为HEV急性感染还是既往感染。有研究表明抗-HEV IgA是HE的急性指标，可代替或辅助现有IgM诊断试剂用于HE诊断，既增加了检测特异性，又能有效减少漏诊。

【关键词】  戊型肝炎；戊型肝炎病毒；抗-HEV IgM；抗-HEV IgA；抗-HEV IgG

　【Abstract】 Hepatitis E(HE),as the spread of acute gastrointestinal disease,is caused by  hepatitis E virus(HEV).Its morbidity is increasing year and year.However,there is neither  specific treatment nor specific passive and active immunity drug to prevent against the disease at present.HEV RNA in blood or stool of patients with acute Hepatitis E can not be widely used due to its short existed time,complicated operation and high cost.Diagnosis of Hepatitis E is made by detection of serum anti-HEV antibody.Anti-HEV IgM is a diagnosis index of acute Hepatitis E,which may be influenced by rheumatoid factor,resulting in false positive.Anti-HEV IgG can generally be detected two weeks after the onset of disease and for at least 1 year.Therefor ,it can not be used to distinguish acute infection from previous infection.Study has showed that anti-HEV IgA is a valuable index for diagnosing acute HEV infections,which is an alternative or supplementary antibody of IgM for detecting HEV infection,increasing high specificity and reducing missed diagnosis.

　　【Key words】 Hepatitis E;Hepatitis E virus;Anti-HEV IgM;Anti-HEV IgA;Anti-HEV IgG

　　HE是由HEV引起的经消化道传播的急性传染病，发病率逐年升高。有研究表明HEV还可通过血液途径传播[1]，而且最近发现HE在器官移植患者中可以慢性化[2]。HEV流行广泛，呈全球性分布，主要累及卫生条件差的亚洲、非洲和中美洲等地区中的发展中国家，在西方发达国家也有散发病例报道，在未暴发HEV的地区人群可检测到抗HEV抗体。在某些发展中国家，HE占成人急性病毒性肝炎的50%以上，尽管只有1%～3%的患者发展为致死性急性肝炎，病死率为2.5％，明显高于甲型(0.1%)和乙型(0.9%)肝炎，孕妇感染后病死率可高达20%。我国曾发生11次HE的暴发或流行，是HE高发区之一，1986年至1988年新疆发生迄今为止规模最大的HE暴发性流行，约有12万人感染[3]。据卫生部发布的传染病疫情公示，近年来我国HE发病数呈现连续增长的态势，死亡率也在逐年增加，已经被列为因HE发病和死亡而引起的经济负担最为严重的国家之一。

　　HEV是一个近似球形的二十面体颗粒，表面有突起和刻缺，形似杯状，无包膜，平均直径为32～34 nm。HEV对高盐、氯化铯、氯仿等敏感，在70℃～80℃中易裂解，在液氮中稳定。HEV的基因组是一单股、正链RNA分子，全长约7.5 kb，由5′端非编码区(NCR)、非结构区(NSR)、结构区(SR)、3′端NCR和3′端Poly(A)尾巴组成，5′端NCR和3′端NCR之间为编码区，包含3个开放读码框(ORF1、ORF2和ORF3)。ORF1主要编码与HEV复制相关的非结构蛋白，包括甲基转移酶、蛋白酶、RNA解链酶及RNA聚合酶。ORF2编码病毒衣壳蛋白，为主要的结构基因编码区。ORF3位于ORF1和ORF2之间，与ORF1和ORF2有部分重叠，编码病毒特异性的免疫反应抗原。作为一种单链RNA病毒，HEV基因组与蛋白质容易发生变异，根据HEV核苷酸序列同源性比较的结果，目前至少可以将HEV分成4个主要的基因型和多个亚型。基因型1：包括3个亚型，分别以HEV缅甸株(1a型)、巴基斯坦株(1b型)和摩洛哥株(1c型)为代表，以往以中国新疆株为代表的中国HEV与巴基斯坦株属同一亚型；基因型2：以HEV墨西哥株为代表；基因型3：由美国株及大多数猪HEV组成；基因型4：包括新近发现的HEV中国株和台湾株[3-4]。ORF2蛋白在已发现的HEV基因型中最为保守，具有很强的免疫原性，其编码的氨基酸序列的同源性并不完全一致，第3型和第4型之间达94.6％，显示了在种系进化上3、4两型间的氨基酸序列相近，可能含有共同的抗原表位。第1型和第2型之间的氨基酸序列同源性达92.2％～92.8％。流行病学资料报道以往我国HE发病以1型毒株为主要病原体，近期的研究报告显示4型HEV是目前引起我国散发性HE的主要病毒株[4]。

　HE是一种严重危害人类健康的全球性疾病，目前尚无特效治疗方法，也无特异性被动和主动免疫制剂可供预防。早期诊断，不仅对于患者的治疗和改善预后具有重要意义，还可以及早发现具有传染性的HE患者，准确评判HE急性感染、亚临床感染、既往感染，对临床处理及预后判断有重要意义。做到及早隔离传染源，防止病毒污染水源和食物，造成大规模暴发流行。

　　1  HEV RNA、抗-HEV IgA、抗-HEV IgM和抗-HEV IgG与HE的关系

　　1.1  HEV RNA与HE的关系   

　　HE潜伏期平均4～6周，在出现临床症状之前或同时即有粪便排毒和病毒血症，然后才出现肝损害，血清HEV抗体在起病前1周左右开始升高，HEV RNA在血清或粪便中出现较早，HEV RNA的检测是HE确诊的指标，但大多数患者的病毒血症持续时间较短，平均约为2周，病毒载量低，所以检出率较低，故RT-PCR法检测HEV RNA阴性的病例不能排除HE。鉴于PCR结果受标本采集时间的限制，而且PCR操作复杂、成本高、易受污染、会造成误诊或漏诊，因此不宜作为常规检测项目在临床广泛开展[5]。

　　1.2  抗-HEV IgM与HE的关系   

　　目前HE的诊断主要依靠血清HEV抗体检测，抗-HEV IgM是HE急性感染的诊断指标之一[6-7]，在感染HEV第2周就可以在血清中被检测到，第6周达到高峰，随后迅速下降，阳性持续时间较短(3个月左右)。而且抗-HEV IgM现有诊断试剂常有漏诊和误诊。众所周知，类风湿因子等的存在会影响血清IgM的检测，造成假阳性，这在其他疾病检测中屡见不鲜，抗-HEV IgM检测也不例外[8-9]。而抗-HEV IgM检测也常常有假阴性报道，Nicand等[5]在抗-HEV IgM阴性的HE亚临床感染患者体内发现病毒血症和粪便排毒；Mitsui等[10]也报道在医疗工作人员系列血清追踪调查中，HE亚临床型感染患者出现短暂病毒血症，而IgM检测持续阴性；Gotanda等[11]报道了在谷丙转氨酶明显升高的献血员中，出现HEV病毒血症却无IgM反应性，等等。最近，Zhao等[9]又发现在11例HEV抗原阳性的HE患者血清中，抗-HEV IgM阴性。这部分漏诊的带毒者即成为HEV的移动传染源，有可能是造成HE区域性小规模流行和持续散发的原因。这说明现有的IgM诊断试剂尚不能满足HEV感染的临床诊断和流行病学筛查与防治的需要。

　　1.3  抗-HEV IgG与HE的关系   

　　抗-HEV IgG一般在发病2周后可检测到，在第7周达到高峰，并能一直保持在较高的水平，至少可持续1年甚至数年，因此抗-HEV IgG不能鉴别患者为HEV急性感染还是既往感染[8,12]。有研究表明IgG抗体亲和力高低测定可诊断是否为急性感染。通常感染初期IgG亲和力低，恢复期IgG亲和力高，但重复感染患者通常也表现为IgG亲和力高。这种情况在孕妇弓型虫感染患者中也有报道。虽然抗体亲和力能用来区分感染时间，特别是亚临床和无黄疸的患者，也可以鉴定抗-HEV IgM阴性的急性感染，但高和低亲和力的区分不得不凭经验，而且不是所有急性感染都是抗-HEV IgG亲和力都低，也有的患者发病早期抗-HEV IgG阳性，而亲和力高，因此抗体亲和力实验只能作为一种验证实验[13]。

　　1.4  抗-HEV IgA与HE的关系   

　　IgA作为免疫球蛋白中一个重要的成员，在黏膜免疫中起着重要的作用。认为可以作为外部屏障作用阻止病毒吸附到黏膜上皮细胞，同时拦截正在感染上皮细胞的病毒，并通过分泌作用将截获的病毒送回到上皮细胞外，已经证实在脊灰病毒、汉坦病毒等感染中，IgA发挥不容忽视的作用[14-15]。EBV-VCA-IgA的检测已被公认是鼻咽癌早期发现、早期诊断、预后监测及大规模普查的敏感、可靠、简便的方法，是提高鼻咽癌早期确诊率的有效途径[16]。IgA抗体被证实在一些病毒性疾病的急性感染期升高，可以作为早期诊断的标志。
在大部分HEV早期感染患者中，可检测到抗-HEV IgM和抗-HEV IgA阳性，但抗-HEV IgA阳性持续时间比抗-HEV IgM长，平均约为(120±23)d，对HEV感染的早期诊断更有意义[8]。早在1993年Chau等[17]就发现血清抗-HEV IgA与IgM同步升高，在恢复期消失，可以作为HEV急性期的感染指标。近年来越来越多的研究证实了这种观点[18-19]，IgA作为HEV急性诊断指标的研究越来越受到人们的重视。Takahashi等[20]在猪感染HEV的研究中发现，抗-HEV IgA与病毒血症的相关性远远高于抗-HEV IgM，提示抗-HEV IgA可以指示排毒。而且有些急性感染的患者没有ALT的升高，会有短期的病毒血症，抗-HEV IgG阳性，抗-HEV IgM阴性，却可以检测到抗-HEV IgA阳性，类似情况在脊髓灰质炎病毒、汉坦病毒引起的病例中也有过相关报道[14-15]。有研究表明抗-HEV IgA是HE的急性指标，可代替或辅助现有IgM诊断试剂用于HE诊断，既增加了检测特异性，又能有效减少漏诊[19-21]。

2  抗-HEV IgA的检测方法

　　2.1  蛋白印迹试验检测抗-HEV IgA   

　　有文献报道用蛋白印迹试验检测抗-HEV IgA[22]，这种方法具有灵敏度高、特异性好的特点，可用作HE患者的确证试验。但这种方法操作复杂，耗时较长，影响因素较多，不适合在临床上广泛开展。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗-HEV IgA的方法，具有灵敏、快速、操作简便、费用较低的优点，操作中可用较少的人力快速处理大批量血清标本，检测结果既可直接用肉眼定性判断，也可借助酶标仪精确定量读数，数据重复性好，结果客观可靠，还可借助全自动酶免分析仪使操作过程实现自动化、标准化，适合临床常规检测，是目前HE实验室辅助诊断方法的研究热点。

　　2.2  HEV IgA间接法ELISA   

　　目前文献报道检测抗-HEV IgA多用间接法ELISA，其原理是将用已包被抗原与特异性IgM、IgG、IgA结合，由于患者血清中存在大量的抗-HEV IgG、抗-HEV IgM与抗-HEV IgA竞争结合位点，从而敏感性降低，须通过去除抗-HEV IgG和抗-HEV IgM来提高其敏感性[9]。同时因间接法所包被抗原采用基因1型或2型HEV重组蛋白或合成肽抗原，有研究表明，用第1、2基因型多肽做抗原对检测第3和4基因型感染患者的抗-HEV IgG、抗-HEV IgM和抗-HEV IgA时，其反应不敏感[23]。最近，Bendall等[13]研究发现，以HEV第1、2基因型抗原建立的ELISA诊断试剂在检测英国本土HEV第3基因型感染的患者血清时，急性期HEV抗体检出率可达95%，而半年后检出率仅为12%。Herremans等[22]则发现以HEV第1、2型抗原检测HEV第1型感染，检出率为100%，而检测第3基因型毒株感染时，检出率仅为67%(ELISA)和57%(immunoblot assay)。由于HEV具有多基因型的特征，不同基因型抗原和感染不同基因型HEV患者血清反应时会出现抗原抗体结合的差异，这是导致一些检测方法漏检的主要原因。因此建立高灵敏度和特异性的ELISA检测方法需要使用具有广泛反应性的抗原，尤其是对我国这样存在多基因型HEV感染的国家以及地区进行临床诊断和流行病学筛查[4]。

　　3  抗-HEV IgA检测需要解决的问题

　　抗-HEV IgA抗体被证实在HEV急性感染期升高，可以作为早期诊断的标志，已经越来越被认可和重视。目前国内外还没有抗-HEV IgA诊断试剂盒正式上市，虽然检测抗-HEV IgA方法已经有了很大的进展，但还存在很多问题：①因各种检测方法采用的抗原不尽相同，因此敏感性差。最早对HEV的研究表明，HEV基因型按地理位置分布，一个地方只存在一种基因型，但是随着新的HEV毒株不断被发现，同一个地区可以存在两种及以上的基因型。随着与经济发展相适应的全球人员流动性的增加以及HEV研究的深入，HEV基因型的地域分布特征已经并将继续发生重要改变。这种情况下，使用多基因型混合抗原建立酶联免疫检测方法，可以大大减少漏诊率。②因为抗IgA与IgA不同片段结合位点的差异，导致检测方法的敏感性也会有较大差异，选择与IgA反应性高的抗IgA单克隆抗体，可提高抗-HEV IgA检测的敏感性和特异性[17]。③IgA可以从黏膜中分泌，故如能取唾液进行检测，不仅方便而且减轻患者痛苦，值得进一步研究。④在免疫球蛋白缺乏症患者中，HEV近期感染者其抗-HEV IgA可能表现为阴性。⑤通过血液传播的患者可逃避黏膜免疫，IgA很低甚至没有。

　　4  抗-HEV IgA检测前景展望

　　目前，对抗-HEV IgA的诊断价值也越来越重视，研制具有高特异性和敏感性的诊断试剂盒具有十分重要的意义。目前IgA类抗体检测方法除了蛋白印迹试验检测，间接法ELISA外，捕获法ELISA也有较好应用，如冠状病毒、脊髓灰质炎病毒等的IgA抗体的检测[14-24]。其原理是首先将高特异性的抗人IgA α链McAb包被于微孔板，专一地捕获血清中的IgA，不与IgM、IgG或其他种类的免疫球蛋白结合，然后抗原特异性IgA抗体与酶标抗原结合，再加入底物液显色。目前IgA捕获法ELISA在HEV抗体检测中还没有相关报道，但张兰芳等[25]已成功建立了基于多基因型HEV混合抗原的IgM抗体捕获法ELISA。该法与间接法ELISA相比，前者阴性本底很低，阴性和阳性结果区别更加明显，便于结果的判断，所用的酶标抗原是不同基因型和亚型混合抗原，抗原性稳定，共同抗原表位在不同基因型之间可诱发交叉中和反应，能检测出来源于不同国家和地区的血清标本，具有较为广泛的血清反应性，漏检的机会少，敏感性高。HEV IgM捕获法ELISA的建立及其他病毒IgA抗体捕获法ELISA的建立为HEV IgA捕获法ELISA的建立奠定了基础。

【参考文献】
  　[1] Matsubayashi K,Kang JH,Sakata H,et al.A case of transfu-sion-transmitted hepatitis E caused by blood from a donor　infected with hepatitis E virus via zoonotic food-borne route[J].Transfusion,2008,48(7):1368-1375.
　　[2] Kamar N,Mansuy JM,Cointault O,et al.Hepatitis E virus-related cirrhosis in kidney-and kidney-pancreas-transplant re-cipients[J].Am J Transplant,2008,8(8):1744-1748.
　　[3] Khuroo MS,Kamili S,Khuroo MS.Clinical course and dura-tion of viremia in vertically transmitted hepatitis E virus(HEV)　infection in babies born to HEV-infected mothers[J].J Viral　Hepat,2009 Feb 18.[Epub ahead of print].
　　[4] 乔伟振，孟继鸿.戊型肝炎病毒基因型地域分布的演变[J].国外医学·病毒学分册，2004，11(1)：29-32.
　　[5] Nicand E,Grandadam M,Teyssou R,et al.Viraemia and fae-cal shedding of HEV in symptom-free carriers[J].Lancet,2001,357:68-69.
　　[6] Yu C,Engle RE,Bryan JP,et al.Detection of immunoglobu-lin M antibodies to hepatitis E virus by class capture enzy-me immunoassay[J].Clin Diagn Lab Immunol,2003,10(4):579-586.
　　[7] Seriwatana J,Shrestha MP,Scott RM,et al.Innis BL.Clinical and epidemiological relevance of quantitating hepatitis E virus-specific immunoglobulin M[J].Clin Diagn Lab Im-munol,2002,9(5):1072-1078.
　　[8] Tian DY,Chen Y,Xia NS.Significance of serum IgA in pa-tients with acute hepatitis E virus infection[J].World J　Gastroenterol,2006,12:3919-3923.
　　[9] Zhao C,Li L,Harrison TJ,et al.Relationships among viral　diagnostic markers and markers of liver function in acute
hepatitis E[J].J Gastroenterol,2009,44(2):139-145.
　　[10] Mitsui T,Tsukamoto Y,Suzuki S,et al.Serological and molecular studies on subclinical hepatitis E virus infection using periodic serum samples obtained from healthy individu als[J].J Med Virol,2005,76:526-533.
　　[11] Gotanda Y,Iwata A,Ohnuma H,et al.Ongoing subclinical infection of hepatitis E virus among blood donors with an elevated alanine aminotransferase level in Japan[J].J Med Virol,2007,79:734-742.
　　[12] 周晖，江楚文，李鲁平，等.两种戊型肝炎IgM抗体诊断试剂的比较[J].中华预防医学杂志，2008，42(9)：667-671.
　　[13] Bendall R,Ellis V,Ijaz S,et al.Serological response to hepatitis E virus genotype 3 infection:IgG quantitation,avid ity,and IgM response[J].J Med Virol,2008,80:95-101.
　　[14] 张礼璧，信洪武，裴红英，等.捕获法ELISA检测脊髓灰质炎IgA抗体方法的建立与应用[J].病毒学报， 1998，9(8)：255-258.
　　[15] 孟祥芝，陈宇萍，李川，等.用重组汉坦病毒NP、GP检测急性期HFRS患者血清中特异性IgG、IgM、IgA抗体[J].中华实验和临床病毒学杂志，2003，17(3)： 254-257.
　　[16] 李群.EB病毒VCA-IgA和EA-IgA抗体与鼻咽癌诊断的关系[J].海南医学院学报，2007，13 (2)：180-183.
　　[17] Chau KH,Dawson GJ,Bile KM,et al.Detection of IgA class antibody to hepatitis E virus in serum samples from patients with hepatitis E virus fection[J].J Med Virol,1993,40(4): 334-338.
　　[18] Zhang S,Tian D,Zhang Z,et al.Clinical significance of anti-HEV IgA in diagnosis of acute genotype 4 hepatitis E virus infection negative for anti-HEV IgM[J].Dig Dis Sci, 2009,54(11):2512-2518.
　　[19] Elkady A,Tanaka Y,Kurbanov F,et al.Evaluation of an- ti-hepatitis E virus (HEV) immunoglobulin A in a serologi- cal screening for HEV infection[J].J Gastroenterol,2007,42 (11):911-917.
　　[20] Takahashi M,Nishizawa T,Tanaka T,et al.Correlation be tween positivity for immunoglobulin A antibodies and viraemia of swine hepatitis E virus observed among farm pigs in Japan [J].J Gen Virol,2005,86(6):1807-1813.
   　[21] Gotanda Y,Iwata A,Ohnuma H,et al.Ongoing subclinical infection of hepatitis E virus among blood donors with an elevated alanine aminotransferase level in Japan[J].J Med Virol,2007,79(6):734-742.
　　[22] Herremans M,Duizer E,Jusic E,et al.Detection of hepatitis　E virus-specific immunoglobulin A in patients infected with hepatitis E virus genotype 1 or 3[J].Clin Vaccine Immunol, 2007,14(3):276-280.
　　[23] Schlauder GG,Dawson GJ,Erker JC,et al.The sequence and phylogenetic analysis of a novel hepatitis E virus iso- lated from a patient with acute hepatitis reported in the U- nited States[J].J Gen Virol,1998,79:447-456.
　　[24] Naslund K,Traven M,Larsson B,et al.Capture ELISA systems for the detection of bovine coronavirus-specfic IgA and IgM antibodies in milk and serum[J].Vet Microbiol, 2000,72(3-4):183-206.
　　[25] 张兰芳，胡正，李梅，等.鼠源性抗人IgM μ链单克隆抗体的制备和鉴定[J].实用医技杂志，2004，11(10B)： 2095-2096.