初探ELISA的分类和发展（一）
引言
1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素和聚苯乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体，建立了酶联免疫吸附测（Enzyme Linked
Immunosrbent
Assay,简称ELISA），后来人们改用板式反应孔进行ELISA，大大地提高了实验通量。ELISA实验具有极高的灵活性，实际操作中人们可以根据自己的需要以及手上已有的材料进行灵活的组合而进行各种可样的ELISA进行反应测定，另外ELISA实验中的相关试剂和耗材都已经商品化，所以ELISA被广泛地应用于生物学的各种研究中。通过ScienceDirect搜索可以看出，1975年只有1篇文献是研究ELISA的，1976年为6篇，但是到2010年这一数字上升到1994篇，历年文献累计达29490篇，足见其研究之广。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA的种类及原理
关于ELISA的分类众说纷纭，不同文献从原理或操作上都有不同的分类意见。这里先将ELISA分为以下四大类，然后针对每一类进行详细讲解：(1)直接ELISA；（2）间接ELISA；（3）夹心ELISA；（4）竞争抑制ELISA。其它的ELISA都隶属于这四类ELISA或由这四类ELISA组合衍生。
【直接ELISA】
直接ELISA是所有ELISA中步骤最简单的一种，其方法是将抗原按一定的比例用包被缓冲液稀释好包被到固相载体上，包被完成后简单洗涤，再加入封闭液，封闭结束后再次洗涤除去多余封闭液，加入稀释好的特异性的酶标抗体，37℃温育一小时或4℃温育过夜后，洗涤除去多余的抗体，加入底物显色并判读结果。最后显色的深浅与加入的酶标抗体量成正比。直接ELISA的原理如图1：
图1直接ELISA原理
一个很常见的直接ELISA实例就是检测单抗亚型，实际操作中可以将经过亲和纯化的单抗包被在酶标板上，封闭后加入酶标分型二抗，最后加底物显色即可。此外用直接ELISA可以检测血清种属，也有人用直接ELISA进行单克隆抗体制备中的初步筛选。不过虽然直接ELISA操作很简单，步骤也比较简练，但是其应用范围还是非常有限的，一个重要的原因是这种ELISA中只经过了一步信号放大（酶的放大），所以其灵敏度不是很高，另外其测定的对象也非常有限，只能测定酶标记的分子。【间接ELISA】
间接ELISA的步骤与直接ELISA步骤前面的部分基本一致，不同的是，间接ELISA中与包被好的抗原结合的不是酶标抗体，而是非酶标的，另外再引入第二种抗体（即二抗），二抗是经过酶标的，它可以与第一种抗体（与抗原直接结合的抗体，即一抗）特异性结合。最后加入底物显色并判读结果。当二抗的浓度一定的时候，最终的显色结果与一抗的量是正相关的。间接ELISA的操作如图2，同直接ELISA将抗原包被到酶标板上，洗涤后封闭，再次洗涤后加入稀释好的待检抗体（一抗），温育后洗掉未与抗原结合的一抗，再加入酶标二抗，再次温育，此时酶标二抗即可与一抗结合，最后加入底物显色。
由于二抗一般为多抗，因此一个一抗分子上可以结合多个二抗分子，同时一个二抗分子上可以标记上多个酶分子，所以当待测抗体为多抗时（可以由多个一抗分子与抗原结合），信号经过两步放大，最终提高了检测的灵敏度。另外由于二抗制备比较容易，而且很早就开始商品化，所以操作者无需要将一抗进行酶标，大大缩减了工作量。在检测抗体的效价、血清的效价以及单克隆抗体的筛选过程中，间接ELISA都是非常重要的实验过程，在临床诊断中，间接ELISA也是检测标志性抗体的重要手段。
图2间接ELISA原理
【夹心ELISA】
夹心ELISA（Sandwich ELISA）总体上可以分为两种：直接夹心ELISA和间接夹心ELISA。直接夹心ELISA又分为双抗夹心ELISA和双抗原夹心ELISA。双抗夹心ELISA的方法是：将第一种抗体（捕获抗体）包被在固相载体上，封闭后加入待检抗原，温育后加入第二种抗体（检测抗体），捕获抗体和检测抗体可以是针对不同表位的两种单抗，也可以是针对同一抗原的一种单抗与一种多抗，但是检测抗体需要经过酶标。双抗原夹心ELISA的原理和操作与双抗夹心基本相同，不同的是包被的是抗原，待检对象是抗体，然后加入酶标抗原，再加底物显色。直接夹心ELISA的原理如图3。
