1.3信号的检测

在洗去未杂交和错配对的探针分子之后，载片培养在免疫荧光试剂中，使其在探针杂交的位置上产生荧光信号，偶联了荧光素分子的抗生物素蛋白被用来标记已掺入到探针分子中的生物素。地谷新，二硝基苯，AFF和硫磺酸盐则可以用相应地标上了荧光素地抗免疫球蛋白来标记。
 最常用地荧光素分子有FITC，rrhodamine和Texas Red等。

1.4分带和信号定位

染 色体地分带可以在杂交前，也可以在杂交后。高分辨的染色体标本是取得最好的带形的基础。常用的分带方法有G（giemsa）带、 Q（quinacrine）带、R（reverse）带，包括色霉素chromomycin A3/偏端霉素distamycin A法；hoechst33258/propidium iodide[3，8-二氨基-5-[3-（二乙基-甲基氨）丙基]6－苯菲碘]法；DAPI[DAPI：4，6-diamidino-2- phenylindole 2HCl]/propidium lodide法，染色体的分带也可以直接用Alu LIHs(LI homo sapiens)或Alu之间的顺序和染色体杂交而得到类似R带的条带。更多的人在努力使杂交信号和分带可以同时在显微镜下看到。

由于杂交和分带同时进行效果不佳，有人采用FL（fractional length）来测量。以杂交信号相对于某固定位置（如端粒）的长度占该染色体长度的比例来表示。

在不分带的情况下，特定的染色体可以通过着丝粒特异，或端粒特异的探针进行共杂交来确定。复杂的探针族，如从一个染色体特异的DNA文库中得来克隆，可以用来修饰和确认染色体，称为染色体绘图。

影响杂交结果的参数有下列几个：探针浓度，杂交时间，探针大小，杂交温度，染色质变性条件染色体得制备和硬化程度，Rnase作用条件，用于降低背景的非特 异性竞争DNA和醋酸酐处理，具体地讲是DNA探针的纯度；用于杂交反应的探针的大小，小心掌握好这些条件，我们就能得到没有荧光背景的特异信号。

FISH 的结果还有一个重要的方面，就是分辨率的问题。影响结果分辨率的因素有两个，染色体上的特异位置和染色体的浓缩程度。着丝粒和端粒的变化比其他的染色体位 置的变化要多，在分析结果时就比较容易辨认。特定的染色体结构在其杂交结果的分辨率上起着重要的作用。制备染色体比较伸展状态的展片，如早中期染色体或中 期染色体，将会得到较高的分辨率。另外，光学系统的进步也是提高分辨率的有效手段。

2.FISH技术的特点
 
FISH技术和同位素原位杂交相比，有着许多的优点。

首先，从探针的制备杂交来看，生物素和其他标记分子没有放射性，标记过程和杂交过程没有污染的危险，比较安全。且用生物素或其他的标记分子标记好以后的探针分子 相当稳定，没有半衰期的限制，可以长期保存。荧光显色时间短，不像同位素杂交要求长时间曝光。背景简单，灵敏度也不逊色。另外，FISH可以用多种颜色同 时显色。这是同位素杂交不可比拟的。这种多色作图，可以使染色体分带和探针信号不同的颜色而同时观察；也可以用不同荧光标记不同的探针，以确定探针在染色 体上的相对位置。

间期核作图也是FISH的一个特色，因为它常常核多色技术结合在一起。中期染色体的FISH的分辨率大约为1Mb，而间期核 作图的精度为50kb。这一精度的变化使FISH有可能直接用于基因作图。可以朔间期核作图技术是遗传研究和脉冲电泳结果的桥梁。与遗传图谱不同，它不依 靠多态性指标和大的家系；也不像脉冲电泳后的稀切点酶物理图谱分析，它不依靠稀切点的存在和甲基化程度，并且不受CpG岛出现频率的影响。它的原理是间期 核上DNA顺序间的距离与线性DNA分子上该两个顺序间的距离呈对应的线性关系。由于这些原因间期核作图可以作为遗传作图核物理作图分析的辅助结果构建染 色体亚区的基因图。间期细胞原位杂交还可用于不能制备中期染色体的细胞的研究，如肿瘤细胞核非周期细胞。

信号扩增也是FISH所特有的。为了 使杂交信号足够强，可以进行信号扩增。扩增的方法是加上一层荧光标记的标记分子的抗体，再加上一层偶联了标记分子的抗体，然后再加上一层荧光标记的标记分 子的抗体，形成三明治结构。以生物素标记为例，在加荧光标记的抗体生物素蛋白avidin之后，加一层山羊生物素标记抗-抗生物素D，然后再加上一层荧光 标记的抗生物素蛋白。

用于人染色体作图的典型探针是cDNA或克隆的基因组DNA片段，大多数cDNA由单拷贝顺序组成，SCP由单拷贝的基因组顺序组成。而大多数的克隆基 因片段中除了单拷贝顺序外还有插入重复顺序（interspersed repeatitive sequence，IRS），如Alu，据分析每3－5kb就有一个Alu顺序，所以在用cos质粒核YAC（yeast artificial chromosone，酵母人工染色体）作为探针时，就会有一些重复顺序干扰单一顺序产生特异性信号。通常将标记好的探针片段变性，与过量的非标记的竞争 DNA一起复性，常用的有人总DNA或Cot1DNA。这是探针中的IRS就很快地与竞争DNA中地IRS结合，剩下的是已标记了单拷贝顺序，所看到的染 色体上的杂交信号就表明了单拷贝顺序所在的位置，这一过程在FISH中叫做抑制性杂交。抑制性杂交的使用使FISH的应用更加广泛，并可能在人类基因组的研究中发挥其作用。