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DNA 酶 I 足迹法对 DNA 上的蛋白质结合位点作图实验

2020.8.10

实验材料 新鲜组织、培养的细胞、来自细胞或组织的蛋白成分

试剂、试剂盒 细胞匀浆缓冲液细胞重悬缓冲液细胞淋洗缓冲液乙醇Ficoll 400甲酰胺染色液MgCl2 CaCl2 溶液NaClNonidetP-40酚:氯仿磷酸盐缓冲液聚乙烯醇终止液组织匀浆液组织重悬缓冲液台盼蓝染料DNA 酶 I变性聚丙烯酰胺测序胶poly(dI-dC)测序胶长度标准品 32P 末端标记的 DNA

仪器、耗材 Beckman SW28 转头或类似产品Sorvall Hl000B 转头或类似产品沸腾的水浴锅 带 B 型研杵的 Dounce 匀浆器 晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管 橡胶棒

实验步骤

材料


缓冲液和溶液

贮存液、缓冲液和试剂的组成请参见附录 1。贮存液需稀释到适当浓度。


细胞匀浆缓冲液

10 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9)

1.5 mml/LMgCl2

10mmol/LKCl

0.5 mmol/LDTT

0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟


含 0.05%(V/V)NonidetP-40 的细胞匀浆缓冲液


细胞重悬缓冲液

40 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9)

0.4mol/LKCl

1 mmol/LDTT

10%(V/V) 甘油

0.1 mmol/L 苯甲基磺酰氟

0.1%(m/V) 抑蛋白酶肽

缓冲液贮存于 0°C


细胞淋洗缓冲液

40 mml/LTris-Cl(pH7.4)

1 mmol/LEDTA

0.15mol/LNaCl

缓冲液贮存于 0°C。


乙醇


Ficoll 400(20%m/V)

Ficoll 溶解在无菌水中,分装成 100ul 并冻存在-20°C。


甲酰胺染色液

10 ml 甲酰胶

10 mg 二甲苯青 FF

10 mg 溴酚兰

贮存于室溫。


MgCl2/CaCl2 溶液

10 mmol/LMgCl2

5 mmoI/LCaCl2

溶液过滤除菌并贮存于室温。


NaCl(5mol/L)


NonidetP-40(0.05%V/V)


酚:氯仿


不含 Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液(PBS)


聚乙烯醇(10%m/V)

聚乙烯醇溶解在无菌水中,分装成 100ul 并冻存在-20°C。


终止液

20 mmol/LEDTA(pH8.0)

1%(m/V)SDS

0.2mol/LNaCl

125ug/ml 酵母 tRNA


组织匀浆液

10 mmol/LHEPES-KOH(pH7.6)

25 mmol/LKCl

0.15 mmol/L 精胺

0.5 mmol/L 亚梢胺

1 mmol/LEDTA(pH8.0)

2mol/L 蔗糖

10%(V/V) 甘油

该缓冲液在使用前需要冰浴预冷。根据需要,步骤 1 前要加人 0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)、1ug/ml 亮抑酶肽、1ug/ml 抑胃酶肽等蛋白酶抑制剂。


组织重悬缓冲液

5 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9)

1.5 mmol/LMgCl2

0.5 mmol/LDTT

0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟

26%(V/V) 甘柚

贮存于 0°C。


台盼蓝染料(0.4%m/V)

取一定量的染料溶于不含 Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液(PBS) 中。室温贮存。


酶和缓冲液


DNA 酶 I(lmg/ml)

酶溶于 10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0), 分装成小份并冻存在-20°C。恰好在步骤 3 以前把溶液以 1:100稀释于冰浴的 10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)。


凝胶


6% 或 8% 的变性聚丙烯酰胺测序胶(见第 12 章方案 8)


核酸与寡核苷酸


poly(dI-dC)(lmg/ml)

取一定量 poly(dI-dC) 溶解在无菌水中, 分装成 lOOul 并冻存在-20°C。加入核酸聚合物是为了减少蛋白与放射性标记 DNA 片段的非特异性结合,结合反应中 poly(dI-dC) 的最佳浓度 (通常为 0~100ug/ml) 需要靠经验确定。其他可用于减低非特异性结合的核酸包括剪切过的基因组 DNA(例如来自子 E.coli、鲑鱼精子或小牛胸腺)、tRNA、剪切后或限制性酶切后的质粒 DNA、poly(dA-dT) 和 poly(dG-dC)。


测序胶长度标准品

通常由靶 DNA 片段进行 Maxam-Gilbert 测序实验中的(A+G) 反应组成。化学测序的方法请参见第 12 章的方案 7。此外也可以使用双脱氧终止法测序反应(第 12 章,方案 3~6), 所用 DNA 的 5'端与 DNA 酶 I 切割得到的 DNA 片段的放射性末端相同。


放射性化合物


32P 末端标记的 DNA[长度 200~500bp, 比活性≥2.5X107cpm/ug(≥5000cpm/fmol)]

DNA 片段的末端标记可以通过以下方法完成:磷酸化(第 9 章方案 13~16, 或第 10 章方案 2); 用 DNA 聚合酶补平 3'-缩进的末端 (第 9 章方案 10 和 11, 成第 10 章方案 7);或用末端标记引物进行 PCR 反应(第 8 章方案 1) 后一种方法更为快速,不依赖于限制性酶切位点,并允许 DNA 结合位点位于末端标记有关的多个位置。不管用何种方法作放射性标记,DNA 片段用于 DNA 足迹反应前部需要用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。

反应中使用的 DNA 片段长度应该为 200~500bp。感兴趣的结合位点至少离放射标记末端 30bp。如果使用更长的 DNA 片段,测序胶的分辨率会变弱。结合位点离末壩太近可能不被 DNA 结合蛋白或 DNA 酶 I 识别。


离心机和转头


Beckman SW28 转头或类似产品,预冷到 4°C

Sorvall Hl000B 转头或类似产品,预冷到 4°C


特殊设备


沸腾的水浴锅

带 B 型研杵的 Dounce 匀浆器

晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管

橡胶棒


辅助试剂

本方案步骤 7~10 需要列在第 12 章方案 8、11 和 12 中的试剂


细胞和组织

新鲜组织、培养的细胞、来自细胞或组织的蛋白成分


方法


1. 用下列 3 种方法中的一种制备核提取物。此外,纯化细胞蛋白得到的组分可以直接用于步骤 2。


从组织制备核提取物


a. 解剖 10~15 g 组织并剪碎。加入冰冷的组织匀浆缓冲液,使碎组织的体积调整到 30 ml。用带紧型研杵的 Dounce 匀浆器勻浆,直到镜检确定大于 80%~90% 的细胞已经破碎。


b. 检测裂解情况是用 10ul 细胞悬液加相同体积 0.4% 台盼蓝染液,在装有 20 倍物镜的显微镜下观察溶液。裂解的细胞吸收染液,被染成蓝色,而完整的细胞不被染色,仍然是透明的。继续进行组织匀浆直到大于 80%~90% 的细胞已经破碎。


C. 匀浆物用冰冷的组织匀浆缓冲液稀释到 85 ml。在晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管中放入 10 ml 冰冷的组织匀浆缓冲液,取 27 ml 稀释的匀浆物铺在上面。以 103900 g(用 Beckman SW28 转头是 24000r/min)在 4°C 离心 40 min。


d. 去掉上清,离心管倒置 1~2 min 使溶液流干。然后把离心管放在冰上。

(可选)用剃须刀刀片切掉管子上部 2/3, 把带有细胞核的余下 1/3 放在冰上。


e. 用 2 ml 冰冷的组织重悬缓冲液重悬细胞核沉淀。精确测量重悬细胞核溶液的体积,加入冰冷的 5mol/LNaCl,使终浓度为 300 mmol/L。轻轻混匀悬浮液,然后冰浴 30 min。


f. 以 103900 g(用 Beckman SW28 转头是 24000r/min)在 4°C 离心 20 min 回收细胞核。小心地把上清转移到新鲜管中。上清分装成 100~200ul 的小份。留下一份用来做蛋白浓度测定。其他的用液氮速冻,并贮存在液氮中。


g. 用 Bradford 法测定上清液的蛋白浓度。


从培养细胞中制备核提取物


a. 从培养瓶、培养血或培养孔中收获 0.5X108~1X108 细胞。在室溫下以 250 g(用 Sorvall Hl000B 转头是1100r/min) 离心收集细胞。用不含 Ca2+的磷酸盐缓冲液洗细胞若干次。


b. 用 5 倍体积冰冷的含有 0.05%(V/V)Nonidet P-40 的细胞匀浆缓冲液重悬细胞沉淀。冰浴 10 min,然后如前离心收集。


c. 用 3 倍体积冰冷的含有 0.05%(V/V)Nonidet P-40 的细胞匀浆缓冲液重悬细胞沉淀,用带有紧型研杵的 Dounce 匀浆器击打 20 次使细胞匀浆。在细胞胀大裂解并释放出完整细胞核的匀浆过程中,匀浆器要埋在冰里。


d. 在 4°C 以 250 g(用 Sorvall H1000B 转头是 1100r/min) 离心收集细胞核,去掉上清,用 1ml 细胞重悬缓冲液重悬细胞核沉淀。精确测量重悬细胞核溶液的体积,加人冰冷的 5 ml/LNaCl, 使终浓度为 300 mmol/L。轻轻混匀悬浮液,然后冰浴 30 min。


e. 以 103900 g(用 Beckman SW28 转头是 24000r/min) 在 4°C 离心 20 min 回收细胞核。小心地把上清转移到一个预冷的新鲜管中。上清分装成 100~200ul 的小份。留下一份用来做蛋白浓度测定。其他的用液氮速冻,并贮存在液氮中。用 Bradford 法测定上淸液的蛋白浓度。


从小量培养细胞中制备核抽提物

本方法适用于转染有质粒的细胞,这些质粒能表达编码转录因子的 cDNA。


a. 细胞用细胞淋洗缓冲液洗若干次。每个培养皿加入1ml 细胞淋洗缓冲液,用橡胶棒把细胞刮到缓冲液中。


b. 细胞悬液转移到 1.5 ml 离心管中,室温下用最大速度离心 2 min 沉淀细胞。


c. 对于原来在每个直径为 150 mm 的培养皿中培养的细胞,加 300ul 细胞重悬液重悬细胞,然后进行 3 次冻融。


d. 在 4°C 以最大速度离心 5 min 去掉细胞碎片。上清(即细胞裂解物)分装成小份贮存在-70°C。


2. 在 1.5 ml 离心管中加入:

核提取物或蛋白组分                      1~23ul

32P 末端标记的 DNA                      1~10fmol

1 mg/ml poly(dI-dC)                        1ul

H2O                                                加到 25ul

可选择加入:

20%Ficoll 400                                12ul

10% 聚乙烯醇                                10ul

在 4°C 大约离心 5s, 使反应液都流到管底。冰浴 10~30 min。


3. 室温下加入 50ul MgCl2/CaCl2 溶液并轻轻混匀。室温下放置 1 min。加入 1~8 稀释的 DNA 酶 I 溶液,轻轻混匀并在室温下放置 1 min。


4. 加 75ul 终止液终止反应。很快地摇匀后,用相同体积的酚/氯仿抽提反应液。


5. 把液相转移到新离心管中,用 2.5 倍体积乙醇沉淀核酸。该乙醇溶液在-70°C 放置 15 min, 然后在 4°C 用最大速度离心 10 min 收集沉淀。用 1 ml 70% 乙醇洗沉淀,再次离心,然后在空气中干燥以去除残存的乙醇。


6. 加入 5~10ul 甲醛染液,剧烈振荡使 DNA 沉淀溶解。煮 3~5 min 使 DNA 溶液变性。


7. 准备 6% 或 8% 变性的聚丙烯酰胺测序胶,加样前进行至少 30 min 的预电泳。


8. 按以下次序加入 DNA 样品:


序列梯带

不含核提取物情况下用 DNA 酶 I 消化后的对照 DNA

含有核提取物情况下用 DNA 酶 I 消化后的靶 DNA

含有核提取物但不含有 DNA 酶 I 情况下培养后的靶 DNA


9. 用足够的恒定功率跑胶,温度维持在 45~50°C。

使感兴趣的序列获得最佳分辨率的跑胶时间要根据经验确定。从甲醛凝胶上样缓冲液中染料的迁移率观察电泳的进程。


10. 电泳结束后,撬开玻璃板,把胶转移到一块厚的杂交纸上。真空干燥凝胶大约 1h, 然后用 X 射线胶片曝光,如果不用增感屏,需要在-20°C 曝光 12~16 h。此外, 干的凝胶也可以用磷屏图像分析(phosphorimage analysis), 大约 1~3 h。


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