抗原修复的选择合适的孵育时间
第一抗体的孵育时间，有较多的使用范围，应用于临床检测抗体的孵育时间。一般室温下孵育在30-60分钟，120分钟，对于研究性质的抗体孵育时间，也可按照上述的时间，但也有人提出于4℃冰箱中过夜孵育，根据我们的经验一般不主张于4℃冰箱中过夜，原因是：
1.长时间的孵育可以使一些非特异性的物质沉淀下来，或者被吸附，造成背景的染色。
2.目前销售的抗体，纯度较高，特异性较强，不需要长时间的孵育，也能够结合得很好 。
3.长时间的孵育，较容易引起切片的脱落，造成染色的失败。
4.长时间的孵育，不利于临床病理报告的发出。
X、连接抗体的选用必须正确，否则可造成假阴性的现象。
免疫组化染色方法较多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，这时就必须要仔细地选择好连接抗体，第一抗体有单克和多克隆炎分，连接抗体则要根据选用的抗体来进行，例如：第一抗体选用的是单克隆鼠抗人**抗体，连接抗体也要选择相应的免抗鼠IgG，这样才能连接上（目前生产厂家已生产出混合型抗体，即既适合于单克隆抗体，也适合于多克隆抗体。使用者不用担心连接不上，随便使用都可，但如果没有订购混合型的试剂盒，就必须注意的型号，使之完全适合所选用的抗体。）孵育的时间可在10分钟，20分钟或者30分钟，一般在室温中进行，如果室温低于20℃以下，则可在37℃的孵育箱中进行。
XI、复合物的使用及孵育时间的确定。
各种方法有各自的复合物，如ABC法，复合物是卵白素和生物素结合的复合物，再带有HRP，SP法，（LsAB法）的复合物是链雪菌素蛋白复合物，再带有HRP，EV二步法的复合物则是二抗和三抗连接在一起的复合物，再带上HRP，除此之外，根据水解底物的不同，可产生不同的颜色，例如：带有HRP的酶，水解的底物一般为DAB产生黄棕色，带AP的酶，水解的底物一般为AEC产生红色。
XII、PBS的冲洗
免疫组化的染色过程，除了前面的处理和加入的抗体外，都在PBS的冲冲洗洗中度过，PBS冲洗的正确与否，也是导致最后结果的关键。
1.单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。
2.温柔冲洗，防止切片的脱落。
冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。
3.冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。
冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS，持续2分钟左右就完全足够了。
4.PBS的PH和离子强度的使用和要求。
刘彦仿指出：中性及弱碱性条件（PH7－8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。[]免疫组化P56我们目前常用的PBS的PH在7.4-7.6浓度是0.01M，根据本室十几年来的使用情况，认为该溶液价格便宜配制方面，使用效果好。
5.常用试剂的配制和使用。
在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加，换，切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。
