本节介绍一种利用结合细菌蛋白质的基质去除粗制免疫球蛋白中与细菌编码蛋白质发生反应成分的方法（de Wet et al.1984)。该方法也适用于利用培养的细胞或组织抽提物去除交叉反应抗体。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。
| 试剂、试剂盒 | 缓冲液和溶液细胞裂解缓冲液NaOHTris-缓冲盐溶液TBSTriton X-100溶菌酶胰 DNA 酶 I制备用于文库筛选的抗体大肠杆菌培养液 |
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| 仪器、耗材 | 离心和转子亲和层析柱溴化氢活化的 Sepharose 4B |
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| 实验步骤 | 材料
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的组分请见附录 12
将贮存液稀释到适当的浓度。
细胞裂解缓冲液
0.1mol/L 醋酸钠
1mol/L NaCl
用 0.45um 滤膜过滤细胞裂解缓冲液，室温贮存。每 1L 培养细菌需要大约 100 ml 细胞裂解缓冲液。
NaOH(1mol/L)
Tris-缓冲盐溶液（TBS) 和含 0.2%(m/V) 叠氮化钠的 TBS
Triton X-100
酶和缓冲液
溶菌酶
使用分子生物学级的溶菌酶。加入固体洧菌酶以辅助裂解细菌。
胰 DNA 酶 I
在细胞裂解液中加入固体 DNA 酶 I 消化染色体 DNA。
抗体
制备用于文库筛选的抗体
利用蛋白 A-Sepharose 亲和层析制备的 IgG 片段，本方案可获得最佳效果。用蛋白 Aipharoae 介质的亲和层析法，请见 Harlow 和 Lane 法（1999)。
培养基
培养液
需要 1 升合适的大肠杆菌培养液。
离心和转子
Sorval GSA 转子或相当转子
Sorval SS-34 转子或相当转子
专用设备
亲和层析柱
5 ml 塞有玻璃棉的塑料注射器或 Bi-Rad Poly-Prep 柱子均适用。
溴化氢活化的 Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech) 或 Affi-GellO(Bia Rad)
载体和菌株
大肠杆菌作为制备表达文库的宿主菌
方法
1. 将适当菌株（如 Y1090 hsdR、XLl-Blue 或 DH1) 的 1L 培养物培养至静止期。
2. 用 Sorvall GSA 转头（5000r/min) 于 4°C 以 4000 g 离心 20 min 收获菌体。
3. 弃去培养基，倒置离心管排出残留培养液。
4. 将沉淀物重悬于 100 ml 的细胞裂解缓冲液中。
5. 加入 200 mg 溶菌酶，于室温温育菌液 20 min。
6. 加入 1 mg 胰 DNA 酶, 和 200ul Triton X-100。
7. 于 4°C 温育菌液 1 h, 或温育至上清由混浊变清亮且黏度降低。
8. 将细菌裂解液于 4°C 以 8000 g(8200r/min 用 SorvallSS-34 转头）离心 20 min, 小心将上清液倒入另一个烧杯内。
9. 用 1mol/LNaOH 将上清液 pH 调至 9.0。
10. 用 Lowry,Bradford 或其他方法检测裂解液中蛋白的浓度。
11. 将提取液骤冷至 0°C, 并按操作说明将菌体蛋白质结合于溴化氢活化的Sepharose 4B 或 Affi-Gel 10。
12. 使用前，用含 0.2%(m/V) 叠氮化钠的 TBS 平衡与大肠杆菌提取物结合的 Sepharose 4B 或 Affi-Gel 10 树脂。
13. 每通过亲和层析纯化 1 mgIgG, 需要 1 ml 固定体积的与大肠杆菌抗原相偶联的树脂。IgG 和偶联的树脂混匀后，在转鼓中于室溫溫育 12~18 h。
14. 将匀浆液装到亲和层析柱上。用 TBS 洗脱抗体。收集洗脱液（每管 0.2 柱床体积）至OD280 降为 0。合并各管抗体，并将亲和纯化抗体贮存于-20°C, 以备免疫筛选时用。 |
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