免疫细胞的检测方法
用体外或体内试验对机体的各种参与免疫应答的细胞进行鉴定、计数和功能测定，藉以了解机体的免疫状态，并对某些临床疾病的诊断，预后及疗效观察等也具有一定意义。
一、免疫细胞的分离
体外测定免疫细胞首先要从外周血或淋巴组织中分离所需的细胞。其主要方法是根据细胞的表面标记、理化性状及功能等方面的差别进行设计。常用的方法有密度梯度离心法辅以花环沉降或亲合板粘附法(panning)等。目前最先进的方法是用荧光激活细胞分离仪(fluorescenceactivited cell sortor，FACS)可自动、快速和大量地分出各类纯度高、活性强的细胞。
(一)外周血单个核细胞的分离
图18.7 淋巴细胞分离(Fieoll密度梯度法)
主要方法为聚蔗糖泛影葡胺分层液(ficoll hypaque)密度梯度离心法。分离人外周血单个核细胞时，通常将分层液的比重配成1.077，肝素抗凝血置分层液上，于水平离心机2000r/min离心20分钟，血液中各种细胞因比重不同而被分开(见图18.7)。此外，分层剂还可选用Percoll、Metrizamid及牛血清白蛋白(BSA)等。分离不同动物血中单个核细胞时，对分离液比重的要求各不相同，如小鼠为1.088，大鼠为1.084，马为1.090等。
(二)T、B及其他免疫细胞的纯化
经密度梯度离心法获得的单个核细胞是不均一的细胞群，还可根据各种细胞的生物学特性、表面标记等进一步纯化。例如单核细胞等具有粘附和吞噬作用，可用玻璃或塑料容器的粘壁法和吞噬羰基铁颗粒的|检验地带网|磁铁吸引法除去或获得。绵羊红细胞能与人T细胞形成E花环，藉此可通过花环沉降法分离T与B淋巴细胞。此外，利用B细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，也可将T和B细胞分开。
为了进一步除去细胞悬液中个别细胞群，尚可将相应的单抗结合于塑料板上，利用亲和层析的原理作亲和板粘附法，或在细胞悬液中加入单抗和补体，以特异性地破坏相应细胞，使获得的细胞悬液更加均一。
(三)免疫磁珠分离法
近年来免疫磁珠法应用较多，基本方法是将特异性抗体标记在磁性珠上，当细胞与标记了特异性抗体的磁珠混合后，两者发生结合，置于磁铁上，吸取上清中的细胞，即可将所需的细胞分离出来。
(四)荧光激活细胞分离仪分离法
是将荧光标记的抗体与细胞悬液混合后装入样品管内，经荧光染色后通过高速流动系统使细胞排成单行，一个个地流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，经超声系统振荡搅动液流，使液流断裂成一连串均匀小滴，每小滴最多含一个细胞，在激光束照射下产生荧光和散射光，经光电倍增管接收，转换成脉冲信号，经电脑处理分辨细胞类型。借助光电效应，当小滴通过电场时可出现不同偏向，即可收集到所需类型的细胞。该仪器能以|检验地带网|5000个细胞/秒的速度高效分离细胞。FACS是集多项功能于一体的细胞分析仪器，除计数细胞外，还可通过荧光染色检测细胞表面标记、细胞增殖周期、区分细胞活性、分选细胞等。
二、免疫细胞的计数
(一)荧光抗体染色
应用范围广泛，可分别使用于B细胞、T细胞及其亚类、MФ及NK细胞的计数及表面标记的测定，多选用间接荧光抗体染色，即活细胞与其特异性单抗作用后再与荧光抗球蛋白抗体反应，经荧光显微镜观察可见膜荧光。
(二)花环形成试验
T细胞与B细胞皆可应用该试验进行计数。计数T细胞的方法称E花环形成试验(erythrocyte rosette formingcell test，ERFC-T)，即取外周血淋巴细胞与绵羊红细胞(SRBC)混合，在一定温度下作用一定时间，使SRBC与T细胞表面的E受体结合，形成以T细胞为中心，绕有SRBC的花环样细胞集团。B细胞计数的方法有|检验地带网|EA花环形成试验EAC花环形成试验，前者将红细胞(E)与相应抗体(A)结合成EA悬液，再与受试者的淋巴细胞混合，经制片染色后镜检，计数花环形成率；EAC花环试验仅在EA花环基础上加上补体，使先形成EAC，再与受试淋巴细胞混合。EA和EAC花环试验分别根据B细胞表面存在着FcγR和补体受体。主要应用于淋巴细胞的分离。
三、免疫细胞功能的测定
(一)T细胞功能测定
1.淋巴细胞转化试验(lymphocyte blastogenesis test) T细胞在体外受特异性抗原(旧结核菌素等)或有丝分裂原(pHA、ConA等)刺激后，能转化为淋巴母细胞。试验时取外周血或分离的淋巴细胞，加入有丝分裂原或特异性抗原，在培养液中培养72小时，经涂片染色后镜检计算转化百分率。正常人为70％左右，转化率低表明细胞免疫功能下降。若在培养终止前6小时加入3H-TdR，经β液体闪烁仪检测淋巴细胞内3H-TdR的掺入量，亦可算出转化率。由于活的增殖细胞具有|检验地带网|吸收四甲基偶氮唑盐(MTT)的能力，活化的线粒体能裂解四氮唑环而产生颜色反应，并借助酶标仪于波长570nm下测吸光值作为判断指标。MTT法简单易行，常被一般实验室采用。该试验可检测细胞的增殖和细胞毒活性。
2.淋巴细胞参与的细胞毒性试验(lymphocyte mediated cytotoxicity test，LMC-T) 系检测CTL的方法。当CTL再次接触靶抗原时，即表现出破坏、溶解靶细胞的特性。这种特性称为LMC，检测时将受试者外周血单个核细胞(效应细胞)与传代的51Cr标记的肿瘤细胞(靶细胞)按一定的效靶比例混合，于37℃孵育一定时间，离心后用γ计数器测定上清同位素强度，其强度与效应细胞的细胞毒性成正比。按下式计算溶解百分率作为判断指标。可通过测定肿瘤患者CTL对肿瘤细胞的杀伤力，判断患者的预后和观察其疗效。
溶解百分率＝(实验组cpm-自发释放组cpm)×100％/(最大释放组cpm-自发释放组cpm)
3.T细胞功能的体内测定法 在临床上常用的方法是体内皮试法，细胞免疫功能正常者可出现硬结、红斑等阳性反应，细胞免疫功能低下者常呈弱阳性或阴性反应。临床上常作为某些病原微生物感染的诊断和观察肿瘤患者的细胞免疫状态、疗效、及其预后的指标。①生物性抗原皮肤试验：分为特异性与非特异性两类，前者包括以结核菌素(OT)、纯蛋白衍生物(PPD)及链激酶-链道酶(SK-SD)等为抗原的皮肤试验，其中以旧结核菌素皮肤试验应用最为普遍。定量注射上述抗原于前臂屈侧皮内，24～48小时观察结果，局部出现红肿，硬结者(＞0.5cm)为阳性。后者多用有丝分裂原如植物血凝素(PHA)作皮肤试验，一般在注射后6～12小时|检验地带网|局部出现红斑、硬结，24～48小时可达高峰，硬结大于1.5cm为阳性。在特异性抗原皮试中，若受试者从未接触过所试抗原，则多不出现阳性反应，因而往往作两种以上抗原皮试，以对受试者的细胞免疫功能作出综合评价。②化学性半抗原皮试：此类半抗原常用二硝基氯苯(DNCB)和二硝基氟苯(DNFB)，皆系小分子物质，进入皮肤后即与组织蛋白结合，构成完全抗原并引起迟发型超敏反应。试验时先将受试者致敏，即将1％DNCB或DNFB丙酮溶液涂于前臂皮肤，24小时后洗去并于2~3周后再以小剂量DNCB或DNFB涂于同侧或对侧皮肤，以24~48小时后发生红肿、硬结、水泡或溃疡为阳性。细胞免疫功能低下或缺陷者，常呈弱阳性或阴性反应。但由于局部反应较大，病人难以接受。
(二)B细胞功能的检测
1.空斑形成细胞(plaque formingcell，PFC)检测 是体外检测B细胞功能的一种方法。该法最早用于实验动物的PFC测定。是以SRBC作为抗原免疫小鼠，从免疫小鼠脾脏分离淋巴细胞或直接用脾细胞，将其与高浓度SRBC混合于琼脂中，经37℃，5％CO2温育后，在补体参与下抗体形成细胞周围的SRBC溶解而形成溶血小区，即溶血空斑(plaque)。一个空斑代表一个抗体形成细胞，空斑的数量表示抗体形成细胞的多少。IgM参与本反应，固定补体能力强，可直接激活传统途径，导致SRBC溶解，称直接法。若检测其他类别免疫球蛋白的抗体形成细胞，需在试验系统中加入相应的|检验地带网|第二抗体才能使SRBC溶解形成空斑，称间接空斑形成试验。近年来，已应用SPA致敏的SRBC结合抗人球蛋白来检测人的抗体形成细胞，此法称SPA-SRBC溶血空斑试验。在此检测系统中加入抗人Ig，能与受检细胞产生的Ig结合成复合物，并通过复合物中抗人IgFc段与致敏SRBC上的SPA结合，激活补体而使SRBC溶解。空斑形成细胞的检测，有助于免疫应答动力学的研究和探讨药物对机体免疫状态的影响。是目前研究B细胞抗体产生功能的重要手段。
2.定量溶血分光光度法(quantitative hemolysis spectrophotometry，QHS) 该法又称B细胞介导的红细胞定量溶血分光光度法，是根据溶血空斑试验的原理衍化而来，可用以测定由B细胞产生和分泌的抗体裂解红细胞所释放的血红蛋白(以吸光值表示)，从而反映机体的体液免疫功能。试验时，将免疫的脾细胞与SRBC及新鲜豚鼠血清等体积混合，于37℃水浴1小时，离心后测上清吸光值，其与产生抗体的量成正比。
3.ELISA-空斑试验(ELISA-plaque assay) 又称酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot，ELISPOT)。该法与ELISA不同之处是，加入的待检标本是细胞，而非可溶性物质；所使用的底物可形成不溶性终产物。ELISPOT不仅可应用于B细胞分泌抗体功能的测定，也能检测分泌细胞因子的T细胞和巨噬细胞。现已有应用该技术于计数类风湿因子分泌细胞的报道，但尚未在临床推广。
(三)其他淋巴细胞功能的检测
1.NK细胞活性测定 包括两个方面：一是NK细胞的自然杀伤活性，另一是ADCC活性。
①NK细胞的自然杀伤功能的检测。NK细胞的功能无需抗原或有丝分裂原的刺激，亦不依赖抗体或补体。其测定方法主要是体外同位素释放法。试验时将分离的淋巴细胞与51Cr标记的敏感靶细胞(K562)共育于37℃4小时，离心取上清用γ计数器测放射性强度，其与NK细胞活性成正比。②ADCC试验。有以下两种方法。第一空斑形成法：是将鸡红细胞在|检验地带网|经多聚L-赖氨酸处理过的玻片上形成单层细胞，加入一定量的抗鸡红细胞抗体及人淋巴细胞，作用一定时间后，由于杀伤性细胞的ADCC效应，使其周围的鸡红细胞被溶解，于低倍镜下可见空斑。计数空斑可算出NK细胞的百分率。第二51Cr释放试验：与空斑形成法的主要区别是观察指标不同。所用的靶细胞除需用相应的抗体处理外，还要用51Cr标记。当靶细胞破损后，标记的51Cr放出胞外，不能再被其他细胞吸收。用γ计数器测量上清中的放射性强度可反映靶细胞破坏程度，从而得知NK细胞的相对水平。
2.LAK细胞活性测定 LAK细胞直接杀伤多种肿瘤细胞的作用依赖于IL-2的存在。若将受检细胞(效应细胞)与瘤细胞(靶细胞)按一定的效/靶比例混合，再加入一定浓度的IL-2，37℃孵育一定时间后即可影响瘤细胞的代谢，进而杀伤瘤细胞。目前多采用同位素标记法，根据加入同位素先后次序的不同，可分为前标记法(试验前先用51Cr标记靶细胞)和后标记法(即在效靶反应后掺入3H-TdR)。前者通过测定上清液的放射性强度判断LAK细胞活性；后者则在培养结束后收集细胞，测其放射性强度，此与LAK活性成反比。
(四)吞噬细胞功能检测
1.中性粒细胞吞噬功能的测定 较早应用的方法为N试验，即中性粒细胞在杀菌过程中能量消耗剧增、耗氧量增加、糖代谢增强，致使糖代谢的中间产物6-磷酸葡萄糖增多，并在己糖途径中氧化脱氢，脱下的氢可被胞浆中的硝基蓝四氮唑(nitroblue tetrazolium，N)所接受，使原来淡黄色的N还原成蓝黑色的沉淀物，沉积在胞浆内。试验时取抗凝血与等体积N混合，37℃温育一定时间后推片，经瑞氏染色后镜下计数百分率，正常人为10%左右，全身性细菌感染患者可见升高。此外，根据细胞的吞噬作用，将抗凝血与等量5×107/ml的菌液混合，经37℃温育一定时间后推片、染色，于油镜下观察细胞吞噬细菌的情况并计算吞噬率和吞噬指数。
吞噬率＝[吞噬细菌的细胞数/中性粒细胞总数(200个)]×100％
吞噬指数＝(200个粒细菌吞菌总数/200个中性粒细胞)×100％
2.大吞噬细胞的检测 ①巨噬细胞吞噬功能的检测：巨噬细胞具有吞噬大颗粒异物的特性，因此常选用鸡红细胞、白色念珠菌、酵母菌等作为吞噬颗粒。将通过斑蟊发泡法获得的细胞与鸡红细胞悬液于体外37℃温育一定时间，离心后取细胞涂片染色，镜检计算吞噬百分率和吞噬指数即可估计病人巨噬细胞的吞噬功能。②巨噬细胞其他功能的测定：巨噬细胞具有多种胞内和胞外酶，也可分泌一些可溶性因子，这些物质在一定程度上可反映该细胞的功能状态。胞内酶通过细胞化学染色法检测，例如最常用的酸性磷酸酶及特异性酯酶的测定。溶菌酶是巨噬细胞的一种胞外酶，其可在体外溶解细菌，若将血清与一定量细菌悬液混匀于比色杯内，经光电比色后记录每分钟光密度变化百分率，与标准曲线相比即可得出标本中血清溶菌酶的含量。
