（四）目的基因片段与克隆载体的连接

PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下：

纯化回收的PCR产物 4μl

Ligation SolutionⅠ 5μl

pMD18-T Vector DNA 1μl

混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。

（五）连接产物的转化

(1) 取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化；

(2) 加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min；

(3) 42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；

(4) 加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；

(5) 制备X-gal平板：取40μl X-gal、 4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；

(6) 取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。

（六）重组质粒的筛选

分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl 氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：

(1) 取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净；

(2) 加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；

(3) 加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；

(4) 加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应；

(5) 4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；

(6) 以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟；

(7) 4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管；

(8) 加入400μl三氯甲烷摇匀， 4℃，12000rpm离心5min；

(9) 取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min；

(10) 弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；

(11) 加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。

(七) 重组质粒的测序验证

将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。

【实验结果】

11. 目的基因的PCR电泳结果。

12. 质粒电泳结果。

13. 测序验证结果。

【参考文献】

1. J.萨姆布鲁克， D.W 拉塞尔. 《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，2002.

2. Wang,W. and Shakes,D.C.Isolation and sequence analysis of a Caenorhabditis elegans cDNA which encodes a 14-3-3 homologue.Gene.1994, 147 (2), 215-218.