一、效应细胞的制备
NK功能效应细胞可取静止的PBMC,或经不同细胞因子诱导的PBMC。 LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或体液(癌性胸腹水)中纯化的淋巴细胞(1×106 /ml)在含有高剂量IL-2(200~1000 μ/ml)的10 %FCS RPMI1640 诱导2~5 天而成。 二、杀伤试验 主要有4 h 51Cr释放法和3H-TdR释放法,前者要求51Cr质量好,同位素半衰期较短,操作所需时间短;后者需要无菌操作,所需时间较长。 1. 51Cr 4 小时释放试验 (1)收获处于对数生长期的靶细胞(K562,LiBr等)洗涤后调整细胞浓度为2×106 /ml (2)取1×106细胞(0.5 ml),加Na251CrO4 100 μci,37 ℃孵育2~3 h,每15 min轻轻振摇一次 (3)用10 %FCS RPMI1640洗涤3 次,每次800 rpm,5 min (4)重悬细胞浓度1×105 /ml (5)96 孔V型或U型培养板中,每孔加100 μl(1×104细胞),每份3 个复孔
(6)每孔加入100 μl不同细胞浓度的效应细胞,最大释放组加入100 μl,1 %TritonX-100;自然释放组加100 μl完全培养基 (7)200 g 离心1 min,37 ℃、CO2孵箱 4 h,200 g 离心1 min (8)每孔取出100 μl上清,γ计数仪上测定cpm值 (9)计算 实验组cpm-自然释放cpm 特异性杀伤率(%)=───────────── 最大释放cpm-自然释放cpm 2. 3H-TdR释放试验 (1)收获处于对数生长期的靶细胞(K562、LiBr等)洗涤后调整细胞浓度为2×106 /ml,加3H-TdR 20 μci (2)37 ℃孵育2~3 h (3)用10 %FCS RPMI1640洗涤3 次,每次800 rpm,5 min 调整细胞浓度为1×105 /ml (4)96 孔U型或平底培养板中,每孔加100 μl(1×104细胞),每份3个复孔 (5)每孔加入100 μl不同细胞浓度的效应细胞,最大释放组加100 μl 1%TritonX-100,自然释放组加100 μl完全培养基 (6)CO2孵箱培养18~24 h (7)每孔吸出100 μl上清,加入胰蛋白酶(终浓度0.15 %)和DNA酶(终浓度为0.0125 %) (8)继续孵育30 min (9)用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上 (10)干燥后,移入液闪瓶中,加入1 ml闪烁液,β液闪仪中测cpm值 (11)计算
实验组cpm 特异性释放率(%)=(1- ────── )×100% 对照组cpm 展开 |