实验步骤

一、材料

这里用到的所有化学试剂都为分子生物学等级，或者用它们最高纯度的等效物。所有的塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸头都要高压灭菌，在核酸实验操作过程中必须始终戴手套。 cDNA A T L A S阵列从Clontech购得。人 19K cDNA 阵列从Ontario 癌症研究所购得。

1 总 RNA 的提取

（1）焦 碳 酸 二 乙 酯（DEPC) (Sigma-Aldrich， St. Louis, MO) 加人水中，终浓度为0 . 1 % 搅 拌 过 夜（> 1 2 h)，高压灭菌。吸头、管子和其他塑料或玻璃
制品可以购买无 RNase 的或者在 DEPC 水中搅拌过夜，去 除 RNase。这部分实验所有的溶液制备和 RNA 样本溶解都需要使用 DEPC 水 和 无 RNase 的塑料或玻璃制品。

（2）TRIzol 溶 液（Invitrogen， Carlsbad， CA)。

（3）氯 仿（Fisher Scientific, Fairlawn， NJ)。

（4）异 丙 醇（Fisher Scientific)。

（5）7 0 % 乙醇 。于 70 mL 无 水 乙 醇（Pharmco， Brookfield, CT) 中加人 30 mLDEPC 水 。

2 RNA 变性凝胶电泳

3 mRNA 提取

（1）Oligotexpoly (A )+ mRNA 提 取 试 剂 盒（Qiagen)。注意：下面列出的 3 种缓冲液是试剂盒配套试剂。 ,

（2）Oligotex 结 合 缓 冲 液（OBB): 20 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5， lm ol/L NaCl,2 mmol/L E D T A , 0 . 2 % (W V ) 十 二 烷 基 磺 酸 钠（SDS; Sigma-Aldrich)。

（3）Oligotex 清 洗 缓 冲 液（OWB): 10 mmol,/L Tris-HCl, pH 7. 5， 150 mmol/LNaCl， I mmol/L EDTA。

（4）Oligotex 洗 脱 缓 冲 液（ OEB) : 5 mmol/L Tris-HCl， pH 7. 5。

4 cDNA 探针合成

（1）1μg mRNA 样本。

（2）聚 合 酶 链 反 应（ PCR) 仪 [ 例 如 Bio——Rad iCycler (Bio-Rad)， PTC-100 (MJ Research)]

5 DNA 阵列杂交和清洗

（1）Church 缓冲液： 0.25 mol/L Na2 HPO4, 0.25 mol/L NaH2PO4, pH 7. 5 ， 7 %SDS (W/V)

（2）20XSSC: 3. 0 mol/L NaCl， 0•3 mol/L 梓 釋 酸 钠（Sigma-Aldrich)。

（3）2 0 % SDS (W / V )

（4） 酵母 tRNA (10 mg/mL) (Invitrogen)。

（5） 小牛胸腺 DNA (10 mg/mL) (Sigma)。

（6）DIG Easy Hybe 溶 液（Roche)。

6 DNA 阵列分析

（1）X 光底片或磷屏成像系统（ 用 于 ATLASTMcDNA 阵列）。

（2） 微 阵 列 分 析 仪（ 分析人的 19K cD N A 阵列）。有很多公司 ( AlphaInn 〇 tech、 Affymetrix、 VersArrayChipReader) 销售阵列分析仪，但有些公司或服务机构(还有很多研究所的设备中心）能够提供收费的阵列扫描和分析服务，这样比购买一台分析仪要经济得多。

3 . 可以下载的分析软件（ 例如 Scanalyze; http://rana.lbl.gov)。

7 结果验证：半定量反转录酶_聚合酶链反应（RT-PCR)

（1）DNAman 软 件（Lynnon Biosoft)。

（2）引 物 设 计 软 件（Scientific and Educational Software)。

（3）BicrRadiCycler (Bio^Rad) 或其他梯度 PCR 仪 。

（4）50XTAE 缓冲液： 242 g Tris 碱 ， pH 8. 5, 57. Im L 冰乙酸， 37.2 gEDTA ， IL 双蒸水。

（5）1 % T A E 琼脂糖凝胶： I X T A E 缓冲液， 1 % 琼 脂 糖（ W/V） , 溴 化 乙 锭（1 μg /mL) 加入到 100 mL 水中。

（6）DNA 上样染料： 0.25% (W/V） 溴酚蓝， 0.25% (W/V ) 二甲苯青， 5 0%(W /V ) 甘油。

（7）DNA 分子质量标准（Invitrogen)。根据预期的 PCR 产物大小选择合适的分子质 量 标 准（从 100 bp 到几 kb 不等)。