生物芯片在功能基因组学研究中的应用进展
生物芯片技术是伴随人类基因组研究发展起来的，它是指通过微电子、微加工技术，在固体基质（如硅芯片、玻片、瓷片等）表面构建的微型生物化学系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸及其它生物组分进行快速、敏感、高效地处理。一般来说，应用芯片进行实验主要包括3个步骤：样品制备、生物化学反应、检测和数据分析处理。生物芯片可分为三类：DNA及寡聚核苷酸
的微型阵列（microarray）芯片（也称为DNA芯片或基因芯片）、蛋白阵列及其它芯片，如样品制备芯片、核酸扩增芯片、毛细管电泳芯片及多功能集成的缩微芯片实验室（LOC）等。近年来，生物芯片技术的应用领域不断拓展，早已从最初的杂交测序延伸到基因组功能研究的各个方面，本文着重对生物芯片中发展最快的DNA芯片和蛋白阵列在功能基因组研究中的应用进展作一个介绍。
1 DNA芯片在突变及多态性研究中的应用
以往的突变及多态性检测手段都不适应大规模、低消耗和自动化的要求，应用DNA芯片方法检测则可克服这些不足，且随
着芯片技术的不断发展，其检测速度、特异性和敏感性也不断提高，尤其是第三代遗传标记单核苷酸多态性（SNP）的出现，使得可以更方便地应用DNA芯片进行大规模多态性检测，进而研究基因多态性和疾病的关系，同时也可以研究致病的机制。
许多人类肿瘤以基因组的不稳定性、多种突变的积等位基因不平衡（allelicimbalace）为特征，杂合缺失（LOH）是等位基因不平衡的常见形式，通过对LOH的检测，可鉴定含有肿瘤抑制基因的基因组区域，并描述肿瘤的临床阶段及发展情况。Mei等联合应用人类基因多态性标记SNPs与高密度DNA微阵列，在整个基因范围内检测等位基因不平衡的情况，他们应用的微阵列含有丰富的探针组，针对于散
布在所有人类染色体的600个基因位点，其检测所得结果用传统的基于凝胶的方法得到了证实。表明了将大量SNPs标记与芯片结合检测LOH及其它染色体改变可实现对等位基因不平衡类型的鉴定，从而促进对肿瘤的诊断及预后评估。
Takahashi等用新近开发的p53基因芯片分析胃肠道肿瘤患者的基因突变，6通过对位胃肠道肿瘤患者的分析，证实了其中一个结肠癌患者的原发瘤样本中，在其外显子8的第273位密码子处发生了杂合性点突变（CGT→CAT），并且，从同一患者的肝转移灶样本中检测到两个杂合性点突变，其中一个与原发瘤中相同，另一个发生在外显子6的第217位密码子上（GTG→GGG）。如果联合应用双色荧光原位杂交（FISH），则不仅可检测p53基因缺失和17号染色体非整倍型，而且可检测p53突变，从而研究胃肠道肿瘤发生发展的机制。
Tonisson等开发了一种基于寡核苷酸芯片的阵列引物延伸（arrayed primer extension,
APEX）方法，其原理是将寡核苷酸引物（其3端与特定SNP或突变位点互补）5末端固定在玻片基质上，患者DNA经PCR扩增，酶消化后与固定在芯征上的引物退火，因而促发了模板依赖性的DNA聚合酶延伸反应，应用四种不同荧光标记的双脱氧核苷酸作为反应底物，通过引物位点的颜色信号改变即可检测突变。他们应用BRCA1基因突变及SNP基因型鉴定芯片作为模型系统，芯片表面化学、模板制备以及APEX反应条件均可优化，可用于进一系列DNA分析，包括SNP检测、基因突变及DNA重新测序等。Kurg等将这种新型芯征用于分析10种常见的-地贫突变，其中9位患者的DNA样品（各携带一种不同的突变）和4个野生型DNA样本均被正确鉴定，且其平均信噪比是40：1，因而足以高度准确地鉴定杂合突变，此研究结果证实了APEX方法可有效地应用于各种DNA的突变和多态性分析。另外，Pastinen等也用类似的方法即微阵列上的等位基因特异性引物延伸反应（allele-specific
primer extension on
microarrays）来进行高通量的SNPs基因型鉴定及突变检测。他们用低丰度物点样制作微阵列，产生可测定40个突变位点或SNPs，的8000种以上的基因型，最后的研究结果显示，所有的已知基因型均被正确鉴定。
2 DNA芯片在基因组的表达及调控研究中的应用
基因在不同组织细胞、不同发育阶段、不同生理病理状态以及各种治疗条件下的表达水平反是非曲直了基因的功能住处，了解这些信息对于阐明疾病的发生发展机制非常重要。利用DNA测序或PCR差异显示等方法研究基因差异表达都较为费力且不灵敏，为了能够全面而不孤立地评价全部基因组的表达情况，需要一种高度敏感和高效率的工具系统，DNA芯片便是适应这一要求的理想选择，它可在一次实验中分析上万个基因的表达模式，且敏感性水平达到<1个拷贝/细胞，从而可提供基因功能线索，有助于鉴定治疗干预的适合靶点，也可用于监测药物治疗后基因表达的改变。近年来，关于芯片在基因表达方面的研究进展非常迅速。
2.1 利用DNA芯片研究疾病状态基因的差异表达模式
CpG岛的过度甲基化是肿瘤中的常见后发事件（epigeneticevent）,最近Yan等发展了一种基于微阵列的方法，称为差异性甲基化杂交（differential
methylation
hybridization,DMH）,他们制备了含1104个CpG岛标签的微阵例，用于筛查28位配对的原发乳腺癌和正常样本，结果显示，其中将近9%的标签在大部乳腺癌样本中的甲基化程度相对于他们的正常对照有显著增加，同时揭示出CpG岛过度甲基化与乳腺癌的组织学程度关。
Elek等从正常人和三个独立的前列腺癌患者体内提取Mrna,将其反转录成cDNA后制备成含588个基因的微阵列，并将其用于基因差异表达分析，发现其中至少19个基因在肿瘤及正常组织中差异表达，提示微阵列与相关cDNA
库结合，能促进对诊断和治疗前列腺癌及其它肿瘤的潜在靶点的快速鉴定。
2.2 利用DNA芯片研究病原体感染后宿主基因表达模式的改变
为了在mRNA水平上全面了解HIV感染CD4+T细胞后产生的总体效应，Geiss等用cDNA微阵列分析了大约1500个受HIV-1感染的细胞的cDNAs，发现在感染后2天左右，宿主细胞基因表达几乎无改变，但在感染后3天时，可检测出20种细胞基因有差异表达。其中包括参与T细胞信号传导、亚细胞运输（subsellular
trafficking）、转录调节的基因以及其它一些未知基因。这些结果支持了关于HIV-1感染将导致大量细胞基因表达改变的假说，并为将来进一步研究差异性表达mRNA产物的功能提供了框架。
2.3 利用DNA芯片检测药物治疗对基因表达的影响
有研究者应用高密度微集芯片在酵母中检测药物治疗对基因表达的影响，在其中一个研究中，应用芯片在酵母基因组水平上检测了激酶抑制剂治疗前后mRNA水平的变化，从而分析蛋白激酶抑制剂对基因表达的影响。另外一项研究报道了免疫抑制性药物FK506作用于酵母后，产生了一种特征性基因表达模式。
这种表达模式在无效突变体的酵母细胞（带FK506作用靶点）中也可观察到，表明部分的药理功能缺失仍可引起相似的基因表达改变。同时，在此实验中也发现了不同于药物最初靶点的其它通路，如果将类似的方法应用于人细胞及组织，将大大提高新药鉴定及药效评估的效率。
2.4 利用DNA芯片进行模式生物体中的基因表达及功能研究 模式生物体的基因组织结构相对简单，但是它们的核心细胞过程和生化通路在很大程度上是保守的，通过对其研究，可加速对人类基因结构和功能的了解。
为了有效的获得有关哺乳动物发育中涉及的基因表达、调节和功能的住处，Kelly等应用ClontechsAtlas鼠cDNA表达微阵列检测了588个已知调节基因在D3
ES细胞（胚胎干细胞）及维甲酸（retinoic acid
,RA）诱导其分化产生的后代细胞中的表达。发现将近50%的调节基因在D3和/或D3分化细胞中表达，其中，分别人18个和61个基因以2.5倍以上的水平发生了下调和上调，这些基因的表达改变具高度重复性，并代表一系列分子标记的表达改变，包括：转录因子、生长因子及其受体、细胞骨架蛋白和细胞外基质蛋白、细胞表面抗原以及细胞间信号转导调节者和效应物。
另外，生物芯片还可用于在模式生物上进行“基因改变——功能改变”的研究，即通过破坏或操纵基因的手段，使靶基因在模式生物基因组中被“敲除”（knock
out）或增中，从而制造出基因敲除动物或转基因动物模型，然后，检测这种模型动物生物学功能的改变，这是了解特定基因功能重要途径。Shoemaker通过PCR打靶策略，使酵母中未知功能的开放阅读框（ORFs）被敲除，从而产生了11株酵母营养缺失突变株，并分别以一特异的20体寡核苷酸序列（将其称为分子条形码）作阅览室记，然后将其置于特殊的生长条件下选择培养，并将合并活突变株的分子条形码扩增、标记后与DNA芯片上的探针杂交，这样方便地定出存活株，并分析ORF的生物学功能，提示此法可扩展到人类基因组未明ORF生物功能的研究，从而促进对生命现象的认识，并为药物治疗提供新的靶点。
3 DNA芯片在比较基因组学研究中的应用
应用高密度芯片对模式生物基因组进行大规模的测序，并对人类基因组进行重新测序，进而对进化过程中各个阶段不同生物基因序列的保守性及差异性进行比较研究，将有助于揭示基因功能和疾病分子机制，阐明物种进化关系。
Hacia等利用芯片技术对与人进化相近的黑猩猩和大猩猩等物种的同源基因BRCA1的外显子11的序旬进行比较分析，证明在3.4kb中有83.5%-98.2%的核苷酸相同，与杂交法和双脱氧测序分析所得的结果一致，这说明芯片技术可大大加快比较基因组学研究的进程。
4 蛋白阵列在蛋白质组学研究中的应用
“蛋白质组”这一名称是由两位澳大利亚科学家Wilkins和Williams于1994年在意大利的Siena召开的双向电泳会议上提出，是指细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式。蛋白质组学就是以蛋白质组为研究对象，从整体上研究蛋白及其修饰状态以及蛋白质之间的相互作用。目前蛋白质组学研究的主要方法是二维蛋白质凝胶电泳。最近，在基于微孔板的传统免疫分析的发展及DNA微阵列技术的推动下，一种新的遗传分析手段——蛋白阵列技术导速发展起来，它可应用于高通量的基因表达分析、分子活动及分子间相互作用等方面。因而它将在蛋白质组学等功能研究领域发挥重要作用。
Walter等将4800种从人胎脑cDNA表达库hExl的液体表达培养中得来的样本排列在丙烯酰胺（polyacrylamide）包被的显微玻片上蛋白阵列，用于进行同步筛查。最近开发出的一种高通量的基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MS），使得蛋白阵列检测结果更加稳定、快速且高度准确。Ge等应采用低密度UPA系统研究分子间相互作用，其中分别采用蛋白质、DNA、RNA以及小分子化学配体作为探针。蛋白阵列也将成为重组抗体文库筛选的首选工具，英国剑桥医学研究委员会的IM
T及其同事已经应用hEx1蛋白滤膜（hEx1 protein
filters）开发一种新的筛查系统，可用于分离针对于人类蛋白质中多不同靶标的特异性抗体。
5 生物芯片技术存在的问题与改进方法
经过十多年发展，生物芯征技术已日臻完善，其应用前景非常广阔，但在现阶段它仍存在一些亟待解决的问题，如该技术需要昂贵的设备，成本较高，且其特异性、灵敏度以及集成度仍有待提高。相信将来随着芯片的大规模批量生产，以及其集成度的不断提高，其价格将不断优化。
针对芯片的特异性问题，有人提出用肽核酸制备芯片，肽核酸是一种核酸类似物，具有很多优点，如亲和性高、适配性好，可识单碱基错配，其杂交受溶液中盐的影响很小。此外Miyachi等开发了一种新的芯片固定技术，他们用hexam-ethyldisiloxane(HMDS)形成的聚合膜（plasma-polymerized
film, PPF）使链亲和素固定于玻片基质上，链亲和素被置于两层HMDS之间，结合了生物素的分子（biotinylated
molecules）能被有效地捕获，而这种HMDS-PPF的疏水性可减少非特异DNA在玻片上的结合，从而大大提高了检测的特异性。
为了进一步提高芯片的敏感性，Taton等用寡核苷酸修饰的纳米金属微粒探针（gold nanoparticle
probes）和传统的平底（flatbed）扫描仪行联合DNA阵列分析，他们应用纳米金属微粒而不是荧光标记探针，此法对含单个错配核苷酸
的靶核酸序列的选择性比荧光标记检测中观察到的要高出三倍，如果进一步将其与一种基于纳米微粒促进的银盐还原（nanopar-ticle
–promoted reduction of silver）信号扩方法偶联时，这种扫描仪阵列检测系统比类似的荧光系统灵敏度要高两个数量级。
另外，不久前Umek等开发了一种生物电子检测平台，这种NDA芯片平台可与同质性分析（homogeneous
assays）相容，因为它无需分别标记，也无需冲洗步骤，其一步完成，电极阵列的分析首先是在室温下进行的，然后将温度提升，此时，含错配靶核酸的电极产生的电信号将在高温下明显减弱。这种芯征可大大加快对突变及多态性的检测。
