胰激肽原酶的鉴别检查方法

鉴别

(1)照紫外-可见分光光度法(通则0401)测定供试品溶液取已测得效价的本品适量,精密称定,加纯度项下的磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解并定量稀释制成每1ml中含10单位的溶液。精密量取4ml,置10ml量瓶中,用上述磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释至刻度。测定法取效价测定酶活力项下的底物溶液2.9ml,在30℃±0.5℃预热5分钟,置1cm比色池中,精密加入供试品溶液0.1ml,混匀,立即计时,使比色池内的温度保持在30℃±0.5℃,在253nm的波长处测定,以上述磷酸盐缓冲液(pH7.0)0.1ml代替供试品溶液,同法操作,作为空白对照准确读取4分钟时的吸光度(A4)和6分钟时的吸光度(A6)求得A值[(A6-A4)/2],按下式计算。AR0.0383a×b式中a为供试品溶液每1ml中的毫克数b为供试品每1mg的效价单位数。结果判定R值(水解速率)应为0.12~0.17。(2)在纯度项下记录的色谱图中,供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。

检查

酸碱度取本品适量,加水溶解并稀释制成每lml中含300单位的溶液,依法测定(通则0631),pH值应为溶液的澄清度取本品适量,加水溶解并稀释制成每lml中含2mg的溶液,依法检查(通则0902第一法),溶液应澄清。(供注射用)脂肪取本品1.0g,置具塞锥形瓶中,加乙醚20ml,密塞,时时旋动,放置约30分钟后,将乙醚液倾至用乙醚润湿的滤纸上,滤过,再用乙醚10ml洗涤残渣,合并滤液及洗液至已恒重的蒸发皿中,除去乙醚,在105℃干燥2小时,精密称定,遗留脂肪不得过5mg相关蛋白酶照紫外-可见分光光度法(通则0401)测定。供试品溶液取本品适量,加纯度项下的磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解并稀释制成每1ml中含1单位的溶液。测定法精密量取供试品溶液1ml置试管中,在35℃±0.5℃水浴中保温5分钟,精密加入已预热至35℃±0.5℃的酪蛋白溶液(取酪蛋白0.6g,加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液80m1l,65℃加热溶解,放冷,调节pH值至8.0,用水稀释至100ml,临用前配制)5ml,混匀,于35℃±0.5℃水浴中准确反应20分钟,再精密加入5%三氯醋酸溶液5ml,混匀,滤过,取续滤液作为测定溶液;另精密量取供试品溶液1ml,置试管中,精密加入5%三氯醋酸溶液5ml,混匀,于35℃±0.5℃水浴中准确反应20分钟,再精密加入上述酪蛋白溶液5ml,混匀,滤过,取续滤液作为空白,在2小时内,在280nm的波长处分别测定吸光度。限度吸光度不得过0.2。纯度照高效液相色谱法(通则0512)测定。磷酸盐缓冲液(pH7.0)取磷酸氢二钠10.9g,磷酸二氢钠2.3g,加水溶解并稀释至1000ml,用50%磷酸溶液调节pH值至7.0。供试品溶液取本品适量,加流动相A溶解并稀释制成每1ml中约含200单位的溶液。对照品溶液取胰激肽原酶对照品(纯度应大于95%)适量,加流动相A溶解并定量稀释制成每1ml中约含200单位的溶液色谱条件用疏水性凝胶为填充剂( TSKgel Phenyl-5PW,7.5mm×75mm,10pm或其他适宜的色谱柱);以含1.7mol/L硫酸铵的磷酸盐缓冲液(pH7.0)为流动相A,以磷酸盐缓冲液(pH7.0)为流动相B,按下表进行梯度洗脱;柱温为25℃;流速为每分钟0.5ml;检测波长为280nm;进样体积20pl时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)100100100系统适用性要求理论板数按胰激肽原酶峰计算不低于1500,胰激肽原酶主峰与相邻杂质峰之间的分离度不得低于0.8。测定法精密量取流动相A、供试品溶液与对照品溶液分别注入液相色谱仪,记录色谱图。将供试品溶液与对照品溶液的色谱图扣除流动相A色谱图(作为空白基线),进行基线校正限度供试品溶液色谱图中,量取空白基线拐点(约16分钟)后所有色谱峰面积,按面积归一化法计算,与对照品溶液主峰保留时间一致的主峰面积不得低于75%(供口服用)或90%(供注射用)。干燥失重取本品0.50g,以五氧化二磷为干燥剂,在0℃减压干燥4小时,减失重量不得过5.0%(通则0831)炽灼残渣取本品0.50g,依法检查(通则0841),遗留残渣不得过3.0%细菌内毒素取本品,依法检查(通则1143),每1单位胰激肽原酶中含内毒素的量应小于2.5EU。(供注射用)