^{图3直接夹心ELISA原理}

^{对于双抗夹心ELISA，待检对象必须包括两个或者两个以上的表位，否则检测抗体无法与待检抗原结合，例如半抗原和小分子抗原都是不能用双抗夹心ELISA检测的。对于双抗原夹心ELISA，其操作与间接ELISA基本相同，但利用特异性的抗原代替酶标二抗，所以特异性比间接法更好。另外，由于间接ELISA中使用的二抗一般只能识别IgG，而双抗原夹心ELISA中任何类似的免疫球蛋白都可以被检测出，因此双抗原夹心ELISA比间接ELISA也更灵敏。}

^{下面我将结合一些试剂盒举例说明加拿大(ANOGEN) human interleukin-8(IL-8),这个指标试剂盒的用到的系统就是这种直接夹心ELISA,在此基础上发展了亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)，以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原），加拿大(ANOGEN) human interleukin-1β(IL-1β)，TNF-α，IL-6 均用到此体系。}

^{间接夹心ELISA是基于两种不同种属来源的抗体的夹心ELISA，其原理是将一种种属来源的特异性抗体包被于固相载体上（作为捕获抗体），封闭，加入待检抗原，温育，洗涤后加入另一种种属来源的特异性抗体（非酶标，作为检测抗体），最后加入酶标二抗（特异性识别检测抗体），再加底物显色。间接夹心ELISA的原理如图4。与直接双抗夹心ELISA相比，间接夹心ELISA中引入了特异性识别检测抗体的酶标二抗，相当于整个体系的信号增加了一步放大系统，于是最终的结果比直接双抗夹心ELISA更灵敏。同时，由于间接夹心ELISA中的酶标二抗仅能识别检测抗体，而不能识别捕获抗体，所以体系的特异性也得到了保障。值得提出的是，间接夹心ELISA并不是严格要求捕获抗体与检测抗体来源于同一物种，也可以是这种情形：仅用特异性的抗体的Fab片段包被固相载体作为捕获抗体，而用未经处理的同种属来源的特异性抗体作为检测抗体，酶标二抗选用只针对检测抗体的Fc段的二抗，这样的酶标二抗同样不能识别捕获抗体，从而使这种体系里的捕获抗体与检测抗体起到类似于不同种属来源的效果。间接夹心ELISA涉及的体系比较复杂，用到的试剂也比其它的ELISA复杂，但是其检测灵敏度上的优越性使它在检测那些低丰度抗原的样品中应用得十分广泛。}

^{图4间接夹心ELISA}

^{【竞争抑制ELISA】}

^{竞争抑制ELISA又叫封闭ELISA，其主要原理是用待检抗原或抗体去干扰已经预先设计好的体系，最终显色的结果与待检抗原或抗体的干扰程度成负相关。竞争抑制ELISA灵活性很强，可以在此基础上设计出更复杂的实验方案，从而派生出所谓的直接竞争抑制ELISA、间接竞争抑制ELISA、夹心竞争ELISA等特殊的ELISA方法。这里仅以直接竞争抑制ELISA和间接竞争抑制ELISA为例简单阐述原理。直接竞争抑制ELISA中，预先将抗原包被在固相载体上，并加入酶标的特异性抗体。实验时，加入待检抗原（或抗体），如果待检对象是抗原，则待检抗原就与预先包被在固相载体上的抗原竞争结构酶标抗体；如果待检测对象是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的抗原。洗涤过程就可以洗掉被竞争下的酶标抗体，最后加底物显色。最终显色的结果与待检原（或抗体）量成反比。直接竞争抑制ELISA的原理如图5。注意在直接竞争抑制ELISA中，同一预制备的体系既可以测定抗原，也可以测定抗体。}

^{图5直接竞争抑制ELISA原理}

^{如同间接ELISA一样，直接竞争抑制ELISA也有两步信号放大的过程，因此其灵敏度也比较高，但是预先包被好固相载体并加入酶标抗体后，实验时只需要将待检抗原或抗体稀释后加到体系中进行反应即可，大大简化ELISA的操作过程。用到此系统的试剂盒如德国(LDN) cortisol，DHEA-S,Estradiol等这些指标。}

^{间接竞争抑制ELISA可以看作是用待检抗原或待检抗体干扰一个预先制备的间接ELISA系统。其具体原理是：将抗原包被于固相载体上，依次加入特异性的抗体以及此抗体对应的酶标二抗作为预制备的体系。实验时，加入稀释好的待检抗原（或抗体），待检标本中的抗原（或抗体）就和预制备体系中固相载体上结合的抗原（或抗体）竞争结合特异性的抗体（或固相载体上结合的抗原）。同间接ELISA一样，间接竞争抑制ELISA也有三步信号放大以其灵敏度也比直接竞争抑制ELISA高。试剂盒（PHOENIX）ACTH,CRF指标中会用到此系统。}

^{从上述原理可以看出，竞争抑制ELISA对试剂的要求非常少，不管是单抗还是多抗都可以用于实验，更重要的是不管被检对象是大分子物质还是多肽、小分子药物、小分子激素等只有一个表位的分子不能使用夹心ELISA的都可以使用竞争抑制ELISA检测。另外，像乙肝标志物检测中，e抗原很不稳定，容易降解变为核心抗原，因此在检测e抗体时不能用夹心ELISA检测而只能选用竞争抑制ELISA。}

^{除以上介绍的几种基本的ELISA外，人们还可以根据自己的实际需要灵活设计其它类型的ELISA，例如引入非酶标二抗或者ProteinA、ProteinG等增加固相载体的载量或者增加系统的特异性等。}