反相液相色谱法测定硝基酚类物质实验
实验方法原理 反相离子对色谱是用疏水的固定相和含有低浓度反离子的极性缓冲液作流动相进行色谱分离的一种方法。它可以用于离子型或可解离化合物的分离，有代替离子交换色谱的趋势，成为液相色谱的一个很有生气的组成部分。最容易被接受的机制是认为解离的溶质与流动相中的反粒子形成疏水性离子对，然后按反相色谱的规律进行分离。反离子的大小及浓度、有机改良剂的浓度和 pH 值均是控制分离的重要因素。
硝基酚类是可解离的有机酸，分离时采用四丁基铵离子作为反离子，在弱碱性条件下，硝基酚类按 pKa值减小的顺序流出。
内标法是广泛使用的色谱定量方法。在进行色谱定量之前，要选择合适的内标物，并准确测定校对因子。硝基酚类的测定采用 2，4—二氯苯酚做内标物。测定校对因子 fi 时，将一定量组分 i 的标准品，与一定量的内标物混合，进行色谱分离，测得的峰面积分别为 Ai和 As，W 代表重量。
进行定量分析时，将需一定量的内标物 S 加入欲测的样品中，进行色谱分离，测得的峰面积分别为 Ai′
和 As′ 则：
W’i 、W’ s′
分别为欲测的样品中组分 i 的量和内标物 S 的量
实验步骤
一、条件
固定相：YWG—C18；流动相：甲醇/水 55:45，含 20 mmol/L 四丁基溴化铵，并用KH2PO4/K2HPO4 调整 pH 值在 7.5—8.5 之间。流量：1 mL/min；检测：紫外—254 nm，0.02AUFS；温度：室温；纸速：5 mm/min
标准测试：对硝基苯酚；2，4—二硝基苯酚；2，5—二硝基苯酚 2，6—二硝基苯酚；2，4，6 三硝基苯酚；内标物：2，4—二氯苯酚
二、[操作步骤]
1、标准品溶液及内标物溶液的配制
（1）准确称取邻硝基苯酚 10 mg，对硝基苯酚 16 mg，2，4—二硝基苯酚 10 mg，2，5—二硝基苯酚 6 mg，2，6—二硝基苯酚 10 mg，2，4，6 三硝基苯酚 20 mg。溶解于 50 mL 甲醇，转入 100 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度摇匀。
（2）准确称取 2，4—二氯苯酚 0.3 克，配成 100 mL 甲醇/水溶液。
2、测定校对因子 Fi 13
将 1 mL 内标物溶液与 1 mL 标物溶液混合。待仪器稳定后，注入 10 μL 混合液，记录色谱图 1
3、 样品的测定
将欲分析的样品与内标物溶液混合。注入 10 μL，记录色谱图 2。根据保留数值，确定试样中含有哪些成分。
注意事项
1、测量色谱图 1 和图 2 中各峰的面积。
2、根据色谱图 1 的数据，计算各组分的相对校正因子。
3、根据色谱图 2 的数据，计算试样中各组分的含量，g/mL
