试剂、试剂盒 TSES 缓冲液TSES 缓冲液饱和酚氯仿辛醇乙酸钾乙醇缓冲液 Almol LNaH2P04 缓冲液氯胺 T 溶液Na125I5 mmol LNa2S2O5lOOmmol LKINET 缓冲液酵母 tRNA蔗糖纤维素柱平衡液三重蒸馏水0.1mol LNaOH5 mmol LEDTA0.1mol LNaCLTES 缓冲液3mol LNaAc甲酰胺

仪器、耗材 SephadexG-25 柱 寡聚脱氧胸苷 (digo-dT) 纤维素柱 多聚尿瞭陡核甘酸柱

实验步骤

一材料与设备

1)TSES 缓冲液：0.2mol/LTris-HCl，0.05mol/LNaCl0.011mol/LEDTA,0.5%SDS

2)TSES 缓冲液饱和酚

3) 氯仿：辛醇 (24:1)

4) 乙酸钾

5) 乙醇

6) 缓冲液 A:0.lmol/LTris-HCl(pH7.4)，50 mmol/LNaCl10 mmol/LEDTA，0.2%SDS

7)lmol/LNaH2P04 缓冲液，pH7.4

8) 氯胺 T 溶液：100ug 氯胺 T 溶于 25ul50 mmol/LNaH2P04

9)Na125I

10)5 mmol/LNa2S2O5

11)l00 mmol/LKI

12)SephadexG-25 柱

13)NET 缓冲液：10 mmol/LTris-HCl(pH7.4)，100 mmol/LNaCllOmmol/LEDTA

14) 酵母 tRNA

15) 蔗糖

16) 寡聚脱氧胸苷 (digo-dT) 纤维素柱

17) 纤维素柱平衡液：0.5mol/LNaCl，1 mmol/LEDTA,20 mmol/LTris-HCl(pH7.6)，0.1%SDS

18) 三重蒸馏水

19)0.1mol/LNaOH

20)5 mmol/LEDTA

21)0.1mol/LNaCL

22)TES 缓冲液：10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)，lmmol/LEDTA，0.05%SDS

23)3mol/LNaAc

24) 多聚尿瞭陡核甘酸柱 (polyuridylic-acid-Sepharose4B)

25) 甲酰胺

二操作方法

1. 酚：氯仿：辛醇法全 RNA 提取与纯化

1) 向纯化的甲型肝炎病毒 (HAV) 内加入一定体积的 TSES 缓冲液。

2) 振荡 30s 至 1 min，置冰浴中 15 min。

3) 加入 1/2 体积的 TSES 缓冲液饱和酚，再加 1/2 体积的氯仿：辛醇, 将混合液振摇 5〜lOmin

4) 在 4°C 下，2500r/min 离心 20 min。

5) 吸出水相，再加入 1/2 体积的 TSHS 缓冲液饱和酚及 1/2 体积氯仿：辛醇，按上述步骤反复抽提 4 次。其水相为全核酸。

6) 全核酸内加入 2% 乙酸钾及 2 倍体积的冷乙醇，-20℃ 放置 2 h 后，用细玻璃棒或长注射针头轻轻搅动，去除絮状物 (DNA)

7) 在 4°C 下，4000r/min 商心 20 min。

8) 弃去上清液，将沉淀再次溶于原体积的缓冲液 A

9) 加蛋白酶 K 至终浓度为 200ug/ml，37℃ 孵育 1〜2 h

10) 再 TSES 饱和酚：氯仿：辛醇抽提一次。在 4℃ 下 4000r/mim 离心 20 min

11) 沉淀复溶于原体积缓冲液 A, 再加入 2.5 倍体积的冷乙醇，一 20℃ 放置 2 h

12)10000r/min 离心 30 min，沉淀为全 RNA。

2. 氯胺 T-蔗糖密度梯度起离心法纯化全 RNA

1)TSES 饱和酚：氯仿：辛醇抽提 4 次可获得 HAV 的全 RNA

2) 向全 RNA 提取物中加入 10ul1mol/LNaH2PO4 缓冲液，10ul 氯胺 T 溶液，如需碘化标记时再加 15ulNa125I

3) 混合物于 25℃ 振摇 25 min

4) 加入 l00ul5 mmol/LNa2S2O5 及 200ul100 mmol/LKI，以终止反应

5) 将反应产物中的碘化物去除. 经 SephadexG-25 柱层析, 洗脱缓冲液为 NET

6) 洗脱收集液用无水乙醇沉淀，沉淀时加入 100ul 酵母 tRNA 为载体。

7) 在 4℃ 下，10000r/min 离心 30 min

8) 再在沉淀屮加入乙醇洗两次，离心同 7)。

9) 沉淀复溶于 NET 缓冲液。

10) 蔗糖密度梯度超离心，取 500ul RNA 样品加入 4 ml15% 至 30% 用 NET 缓冲液制备的蔗糖禅度溶液。在 7℃下，310000r/min 比离心 2.33 h。离心后可见 4 个峰，即 4S、18S、28S 及 35S. 酶特异性实验证明，35S 部分对 DNA 酶不敏感，而对 RNA 酶敏感，因此，这一部分被证明是 HAVRNA。

3）Poly(A)+RNA 的提取

经上述酚：氯仿：辛醇及密度梯度超离心后，对于所收集的 35SRNA 部分可釆用下列方法分离含多聚 (A) 的 HAVRNA。

1) 寡聚脱氧胸苷 (oligo-dT) 纤维素柱层析分离法。①柱床根据分离暈而定，如 0.5 cmX2 cm 或 lcmX4.5 cm 等。②用纤维素柱平衡液平衡纤维素。③装柱，以无菌的三蒸水和 0.lmol/L NaOH 及 5 mmol/L EDTA 循环洗三次，最后以水洗，再用含 0.lmol/L NaCl 的平衡液洗一次。④加样，样品用无菌的三蒸水稀释，水浴处理 5mim, 冷却, 加入柱内⑤用 2〜3 倍柱体积的 TES 缓冲液洗脱，收集洗脱液，洗脱至 A260<0.03。⑥收集 A260 峰值部分，加 3moL/LNaAc 及 2.5 倍体积的乙醇，一 20℃ 放置⑦在4℃，10000r/min 离心 30 min.⑧沉淀复溶于水，测 OD 值，计算 RNA 含暈，即得含多聚（A) 的 HAVRNA

2) 多聚尿嘧啶核苷柱（polyuridyncaad-Sepharcst-4B) 层析法。实验操作方法及步骤与 1) 法基本相同。柱床为 lcmX2 cm, 柱层平衡液为 1 份甲酰胺及 3 份 NET 缓冲液，平衡和洗层析柱 5 次. 含多聚（A)RNA 洗脱收集液为 9 份甲酰胺及 1 份的 NET 缓冲液，RNA 洗脱收集后，沉淀、浓缩及干燥。RNA 样品应储存于-70℃ 备用.