CELL：致癌病毒附加体维持的核心作用机制
Cell | 致癌病毒附加体维持的核心作用机制
EB病毒（Epstein-Barr virus）又被称为人类疱疹病毒第四型，是一种具有致癌性的病毒，在增殖的宿主细胞中以多拷贝附加体（Episome）形式存在。EB病毒附加体的维持严格依赖于EBNA1，该因子是序列特异性DNA结合蛋白，但是一直以来对于该蛋白酶活性方面的研究还未见发掘。
近日，来自美国费城威斯达研究所的Paul M. Lieberman研究组在Cell杂志上发表了一篇题为Cell-cycle-dependent EBNA1-DNA crosslinking promotes replication termination at oriP and viral episome maintenance
的文章，揭示了EBNA1通过与DNA交联促进在oriP位点的复制终止实现附加体维持的具体分子机制。
EB病毒长期潜伏感染，会增加癌症和自身免疫疾病的风险【1-3】。EBNA1是潜伏感染期间病毒DNA复制和附加体维持所需的唯一病毒蛋白【4】。EBNA1是一个具有特定DNA具有高亲和性结合的因子，但是一直以来领域内对于该蛋白的认识认为其缺乏固有的酶活性【5, 6】。EBNA1会结合在病毒质粒复制起始点的重复DNA识别元件oriP位置处，其中包含一个FR（Family of repeats）重复序列以及一个DS（Dyad symmetry element）对称元件。oriP也是复制分叉终止并形成重组结构的区域【7】。但是目前为止对于EB病毒DNA在oriP位置复制叉阻遏并终止的具体机制还不得而知。
为了揭开这一问题的答案，作者们首先利用RADAR（Rapid approach to DNA adduct recovery）技术对EBNA1与DNA的共价交联进行检测，该技术先前已经被用于例如拓扑异构酶与DNA交联的检测【8】。作者们发现，利用RADAR技术可以检测到EBNA1与DNA形成加合物（图1）并且发现该加合物的形成是细胞周期依赖的。
为了对EBNA1中参与DNA交联的原理进行解析，作者们检测了EBNA1的蛋白质与DNA结合的 2.7 埃分辨率的晶体结构。通过引入不同突变并结合RADAR技术对与DNA交联能力的检测，作者们发现EBNA1中Y518位点突变导致EBNA1-DNA加合物形成的能力显著降低。作者们想知道DNA交联加合物形成能力的降低是否是由于该位点的突变影响了EBNA1与DNA结合的能力。为此，作者们通过ChIP实验对野生型的EBNA1与Y518突变型的EBNA1结合DNA的能力进行检测后发现，Y518F突变型的EBNA1可以结合oriP
DNA且结合能力与野生型类似，但是不能在蛋白未变性的天然构象下形成共价的DNA加合物。另外，通过进一步对Y518F突变体对病毒功能性的影响进行评估，作者们发现Y518F的突变会显著降低病毒oriP质粒的维持以及DNA复制
为了揭开Y518位点对于附加体维持的具体机制，作者们进行了对活细胞中DNA复制和重组结构进行了2D中性琼脂糖凝胶分析。通过该实验，作者们发现Y518位点对于在oriP位点高效的复制叉暂停是必须的，而且这些活性与EBNA1-DNA交联以及附加体功能维持相关。另外，作者们想知道EBNA1与DNA磷酸骨架交联是否与核酸内切酶活性相关，作者们对EBNA1与oriP中FR重复序列或者是4WJ（4-way Holliday junction）的复合物进行了纯化。作者们发现野生型的EBNA1会在DNA底物上在特定位点产生强力的切口，而在Y518突变体的纯化复合物中则并未发现相同的切割位点。该结果证明了EBNA1 Y518位点对于DNA核酸内切酶活性非常关键。
总的来说，该工作发现EB病毒中DNA结合蛋白EBNA1对于附加体的维持以及致癌性非常关键，EBNA1会与oriP
DNA形成细胞周期依赖的共价DNA交联加合物，而其中的具体机制则是因为EBNA1中包含关键的、进化上保守的Y518位点，该位点的突变会破坏DNA交联以及EB病毒附加体的维持，而EBNA1实现该功能主要是由于该DNA结合蛋白具有位点特异性的核酸内切酶活性，该酶活性对于DNA复制叉在oriP位点的终止非常关键。因此，该工作为EBNA1作为药物开发靶点提供了重要的研究依据。
