质谱沙龙第十五期活动报道

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质谱沙龙第十五期活动报道

2008.12.29

2008年12月21日下午，质谱沙龙第十五期活动在第二炮兵总医院远程会诊中心会议室举行。来自发酵研究院、清华大学、二炮总医院、朝阳医院、北大医学院、北医三院、安贞医院、解放军307医院、中科院植物所、AB公司的各位专家、老师、学生20余人。

质谱在植物代谢组学中的应用

首先由中科院植物所的杨芬博士结合自己的研究课题，为大家做题为《质谱在植物代谢组学中的应用》。代谢组学是系统生物学的一个组成部分（注：基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学四个组学组成了系统生物学）。系统生物学是研究一个细胞、组织、器官内所有物质及其代谢物信息的科学。代谢组学最早是英国帝国理工学院的杰里米·尼科尔森教授提出的，从上个世纪80年代开始，他致力于研究大鼠血液、尿液的代谢物及其与疾病的关系，被誉为国际代谢组学之父。代谢组学主要是研究在新陈代谢动态的进程中代谢产物变化的规律，从而揭示机体、生命活动代谢本质的一门学科，其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。

中科院植物所杨芬博士

代谢组学的研究主要分为三个部分：样品制备、中期代谢产物的分离检测鉴定、到最后数据分析与模型的建立。

代谢组学在植物领域应用也非常广泛。比如：（1）它作为一个桥梁，将基因产物与基因关联起来，从而实现基因功能的鉴定。比如植物中常使用的模式植物拟南芥，拟南芥中90％的突变体是“沉默”型的突变体，很难通过表现型的变化来确定有关基因的功能。转基因的生物或者敲除某些基因的突变体中的代谢物的含量会发生变化，通过监测代谢产物的变化，把其与野生型区分开来，从而实现基因功能的鉴定。（2）可以推断有关基因的功能。（3）能够找到代表植物表型的一些标志性化合物，从而对植物的表型进行分类，比如Fiehn 研究组用GC/MS的工作，就发表在Nature上。

接着，杨芬博士介绍了其研究组在研究花生代谢组学方面的一些进展（正在研究，详情不再介绍），主要为大家简单介绍代谢组学的研究流程。去胚的花生被某种菌侵染（不产毒菌侵染的作为对照，另一个样品为产毒菌侵染的）后，在28℃培养，进行不同的样品提取步骤后，分别用GCMS和LCMS分析，得到代谢物的质谱，然后对数据进行预处理、多变量分析，比较1～7天的结果，最后找到标志性的化合物。在结果演示中，主要展示了LC/MS一级质谱和二级质谱的结果，比如她们通过对比后，发现了几种标志物。

在数据处理中，主要用了仪器公司自带的软件（MarkLynx），公司的软件将数据预处理和多变量分析整合在一起，给出结果；但公司的多变量分析软件只能用PCA方式，而且看不到数据预处理的方式，最后她们的研究小组没有采用。另一种处理方法利用了两个免费软件，MetaLAN进行数据预处理，并可清晰地看到数据预处理的过程，比如基线处理，两组数据间的TIC图比较。MetaLAN数据预处理后，将数据导入到另一个软件进行分析，并可选取多变量分析的方法，比如最终选择了PLS_DA的模型和结果。（注：PCA主成分分析；PLS偏最小二乘法；OPLS正交偏最小二乘法）

代谢组学目前存在的问题是：比如没有一种分析手段可以对研究体系中所有的化合物进行代谢组学分析；样品的变异；仪器的动态范围局限性；代谢组学产生海量的数据，还要开发更多的信息学的工具。

研究的挑战和未来的研究方向：如何把代谢组学的数据和其它三种组学的数据，以及代谢途径、表现型数据分析的数据整合在一起，才能给出整个系统生物学中一些问题的解释。

提问中，在座专家问了一些问题，杨博士一一给予解答。比如关于为什么要用气质测定脂肪酸？这是因为农作物中，含高油脂的化合物更容易感染毒菌，比如花生的脂肪酸含量大约80％以上，用气质联用主要是看脂肪酸的含量、代谢是否和产毒有关。另外关于实验的重复性，实验至少要重复两次；样品量要有保证，真正在做植物代谢组学实验中，得用6～8个样品同时做。植物代谢组学的数据库目前非常少，目前只可以获得番茄的代谢组数据库。用LC/MS/MS的二级谱图与标准品对照，可以最终识别可能的代谢物。

生物标志物验证的整体解决方案——MIDAS™技术流程

AB公司亚太应用支持中心的应用工程师郭立海为大家介绍了题为：《生物标志物验证的整体解决方案——MIDAS™技术流程》的报告。

AB公司亚太应用支持中心的应用工程师郭立海

生物标志物的整个研发流程中，有四个阶段：Discovery、Candidate Verification、Candidate Validation、Clinical Utilization。目前国内的生物标志物研究主要处于Discoery阶段；而AB公司的这个报告，主要是想推动大家向下一阶段迈进。在Discovery阶段，样本量比较少，找到的生物标志物可能不是真正的标志物，这时，除了要尽可能使用准确可靠的标志物发现技术比如iTRAQ试剂，还要进入标志物验证的阶段。在验证阶段，过去常用Western-blot，ELISA方法，但耗时耗力，不能做到规模化，而且需要抗体，没有抗体或抗体不好制备时就无能为力，解决办法是发展快速、准确的高通量技术方法，不需要抗体，只要知道需要验证蛋白是什么。ABI推出的MIDAS流程正是为了解决这个问题。

MIDAS™技术（又叫 “MRM Triggered IDA”）结合了Qtrap质谱仪串联四极杆的高选择性的MRM扫描和线性离子阱高灵敏度的MS/MS扫描功能。MIDAS™流程的特点是：可以定向检测低丰度的肽段或翻译后修饰，既具有特异性，又具有高灵敏度；一次实验中，用于检测的MRM可以定量多个候选物，而用于确认鉴定的MS/MS扫描进行目标确认增加了MRM的可信度；可以直接用酶解样品（如血液等）来建立MRM方法；方法建立很快：直接从发现到验证；成本低：不需要合成肽段。

MIDAS Qtrap工作模式

关于为什么要用Qtrap，郭工举了几个例子：（1）在做MS/MS全扫描时，线性离子阱的灵敏度比串联四极杆高100倍；（2）MRM可能会产生误读，比如一个肽段的MRM在预定的时间获得了很高的信号强度，但MS/MS谱图却与假定的biomarker肽段匹配不好，数据库检索证明是丰量蛋白hemoglobin的肽段，而不是真正的Biomarker。

MIDAS的工作流程为：从文献、蛋白质组或基因组的数据，将蛋白酶解后产生理论的肽段，根据理论预测进行MRM相对定量，同时用MS/MS鉴定。工作流程如图：

MIDAS™的工作流程示意图

同时，ABI还提供了多个实现MIDAS™的软件：

MIDAS™ Workflow Designer：根据肽碎裂规律，利用蛋白序列自动生成MRM离子对，并创建IDA方法
MRMPilot™ Software：利用蛋白序列或实际MS/MS数据自动生成MRM离子对，并创建IDA方法
MultiQuant™ Software：对MRM数据进行分析，可进行相对和精确定量
Scheduled MRM：根据保留时间最大程度地提高分析物数目，从而提高MRM效率（第十四期质谱沙龙曾介绍）

郭工还介绍了在生物标志物的验证阶段，实现MIDAS实验良好重复性的试剂：mTRAQ™试剂，它是一种定量的内标，实现归一化，提高定量实验的重复性和一致性。其特点为：

是一种非同重同位素标签，基于iTRAQ™试剂发展而来（iTRAQ试剂是同重标签），标记原理、方法和效率相同，实现了生物标志物发现和验证两个阶段的无缝链接
在MS或MS/MS，轻、重标记都有4amu的质量差异，这一点与iTRAQ试剂不同
可以针对高质量碎片离子设计特定的MRM离子对：提高了特异性、降低了噪音（LC/MS的高质量端噪音较低）
MRM的轻、重标记的离子对在Q1和Q3的质量数都是不同的
轻、重标记的肽段在色谱上表现为共洗脱

mTRAQ试剂示意图

郭工举例显示了模拟真实条件下的、不利用自动进样器的uL级进样中，在引入内标后，蛋白定量的重复性得到了提高（大部分肽段的定量CV值从15～30％，降低到<10%）；而如果对每个蛋白取几个肽段，结果再对肽段做平均，可以进一步提高定量的重复性（有更多的肽段定量实验CV值<10%）。

因此，在生物标志物鉴定中，ABI提供多种解决方案：在Discovery阶段，可用4800 Plus TOF/TOF或QStar结合iTRAQ试剂、ProteinPilot软件；在验证阶段，均可以使用4000 QTap、mTRAQ试剂和一些应用软件。

郭工讲毕，大家对新技术表现出浓厚热情，尤其是前几期沙龙中，曾介绍过用iTRAQ进行氨基酸定量的技术，大家比较关注技术的区别。郭工再次为大家区分了iTRAQ和mTRAQ试剂：两者都是同位素标记的试剂，iTRAQ是等重的，即在一级质谱中被标记的几种物质是一样的，在二级质谱中得以区分；而mTRAQ是非等重的，被标记的物质在一级质谱、二级质谱中的分子量都会不同，同时，mTRAQ加大了质量差至4 amu，所以特异性、准确度会更高。当然，在验证阶段，用一对（两个）标记就可以了，它是作为内标，用于定量的是MRM离子对；在Discovery阶段，现在的iTRAQ试剂常会比较2～8个样本，所以，iTRAQ标志物的离子对会存在2～8个，用于定量的是全扫描状态下的二级碎片离子（如113、114、115、116、117、118、119、121等）

报告下载：生物标志物验证的整体解决方案——MIDAS™技术流程

最后，由李鹏飞老师主持，讨论了一些液质联用使用过程中的常见问题。大家讨论了明年质谱沙龙的一些活动计划，比如仍然将侧重于液质联用，药物等小分子研究，但也会增加气质联用、蛋白等大分子研究的讨论。