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Southern 杂交技术-2

2020.9.14

三:操作

(一)转膜

1电泳

2切胶 在紫外下,切取凝胶有条带部分

3脱嘌啉0.25NHCL浸泡凝胶10分钟,蒸馏水洗胶(大于15kb的DNA片段转移时做此步骤)

4变性,变性液(0.5MNaOH、1.5MNaCL)浸泡凝胶2次,每次15分钟,蒸馏水洗胶

5中和,中和液(0.5Mtris-HCL,pH7.0、3MnaCL)浸泡凝胶2次,每次15分钟,蒸馏水洗胶

6平衡,凝胶在20×SSC中室温平衡10分钟

7转膜,取一塑料盒,将一干净玻璃板横架于盒上,盒中倒入10×SSC,作为转移缓冲液,将2张大小合适的滤纸用20×SSC溶液浸湿,放置于玻璃板上,作为滤纸桥

将处理好的凝胶切去多余部分并切下一角作标记,胶面反转放置于滤纸桥上,四周用Parafilm膜封闭,以防短路

剪取一块面积稍大于凝胶的硝酸纤维素膜(NC膜),以2×SSC溶液浸湿后置于凝胶上

剪取2块相应大小的滤纸,以2×SSC溶液浸湿后置于NC膜上

(滤纸、凝胶、NC膜、滤纸间都不能有气泡)

滤纸上面放一叠吸水纸,上面压一块玻璃板,再压上500g左右的重物,转移过夜

8烤膜,转移结束后,NC膜在与凝胶切角相对处,用铅笔做记号,用6×SSC溶液室温漂洗5分钟,以充分洗去沾上的凝胶成分,吸水纸吸干残余液体,室温晾干,NC膜用滤纸夹裹好,80℃烤膜2小时

9烤干的NC膜用2×SSC浸润。

注:

1:在7操作中每层间应确保无汽泡存在。

2:操作中吸水纸的大小应小于顶层滤纸,且不能于滤纸下的任何一层接触。

3:烤片的作用在于使已转移条带更牢地结合于NC膜上。

(二)杂交

1封闭,将杂交好的NC膜用滤纸吸干,放入一新杂交袋中,用封闭液42℃封闭2-4小时(封闭液用量为4ml/50cm2膜)。

2预杂交,将上部浸润的NC膜装入杂交袋,加入预杂交液(0.2ml/cm2膜),使膜与预杂交液充分混匀,赶走汽泡,封口。65℃2-4小时。


3杂交,倾出预杂交液,加入杂交液(预杂交液+临用前变性的标记好探针,终浓度为1-2ng/ml)(0.2ml/cm2膜),65℃过夜。

4洗膜,用洗涤液A,B分别洗膜两次,每次洗膜液体积不少于250ml。

5反应,弃去封闭液,加入亲和素-碱性磷酸酶溶液,室温避光反应15分钟,轻轻震荡。取出膜,用洗涤液C,D分别洗涤三次,每次洗涤体积不应少于300ml,每次5分钟,振荡。

6显色,将膜转入新袋中,加入底物溶液(用量为4ml/50cm2膜)。封袋,避光放置,显色数分钟至数小时,以杂交带清晰,背景低为好。

十五-2:DIG试剂盒杂交实验

一仪器:同十五-1

二试剂: 变性液:0.5MNaOH、1.5MnaCL

中和液:0.5Mtris-HCL,pH7.0、3MnaCL

20×SSC溶液(同十七-1)

预杂交液:Blocking溶液(试剂盒带)

杂交液(含5-25ng/ml,DIG标记探针的预杂交液)

low stringence buffer(2×SSC,0.1%SDS)

high stringence buffer(0.5×SSC,0.1%SDS)

洗涤液(0.1M马来酸,0.15MNaCL,pH7.5,0.3%Tween-20,)

抗体溶液(含1/5000的DIG标记碱磷酶的Blocking溶液)

平衡液(0.1MTris-HCL,0.1MNaCL pH 9.5)

显色液(平衡液中含2%BCIP/NBT储存液)

BCIP/NBT储存液(试剂盒带)

三:操作

(一)转膜 同十五-1

(二)杂交

1预杂交,将烤好的NC膜放入一个比膜稍大的塑料袋中,按100cm2/10ml的比例加入适量的预杂交液,赶走气泡,封口机封口,42℃预杂交30分钟

2杂交,倒掉预杂交液,按100cm2/10ml加入杂交液,42℃杂交过夜

(三)检测

1准备好一个塑料盒,放入100mllow stringence buffer,将杂交后的NC膜取出,置于上述溶液中,室温晃动5分钟

2取新鲜的low stringence buffer,重复上述操作一次

3将NC膜取出,置于65℃预热的100ml high stringence buffer,65℃晃动15分钟

4取新鲜的high stringence buffer,重复操作一次

5将NC膜转移至塑料盒中,内含洗涤液,室温晃动2分钟,倒掉洗涤液。

6加入100mlBlocking溶液,室温晃动30分钟,以除去没有特异结合的探针,倒掉Blocking溶液

7加入20ml抗体溶液,室温晃动30分钟,倒掉溶液

8用洗涤液室温晃动洗涤2次,每次15分钟,以除去多余的抗体,倒掉洗涤液

9平衡,加入20ml平衡液,室温放置3分钟,倒掉平衡液
10显色,加入10ml显色液,显色,目标条带显色后用50mlTE终止反应。


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