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以PCR为基础的检测工具的优缺点

2021.5.22

第一,PCR反应是快速的。整个DNA提取,扩增和检测的过程通常少于6小时,如果反应利用嵌套的引物,过程可能长些。对于一些样本来说,比如来自粪便和表皮,就需要在DNA提取中增加步骤,这样就延长了整个检测的时间到14小时。
  
用购买的核苷酸提取工具就能缩短检测时间,同时机械进行提取,使PCR方案最优化或使用加快热循环技术。有了优化的样本,快速提取和光循环热循环,整个检测时间能缩短到2小时。但通常是6-8小时。
  
与以培养基为基础的方法要花2-5天的时间相比较,这是巨大的进展了。这也比一些需要有精确计算结果的培养基浓缩的抗体检测实验要快。当购买的实用抗体基础的检测工具比PCR基础的方法快时,大部分这样的化验只能用于非常有限的生物体上。

第二,PCR不需要培养。这是与PCR基础的检测的速度密切相关的。既然PCR是十分灵敏的(少到10 cfus的样本就能被检测),培养通常是没必要的。大多数最新的实用PCR检测工具需要有选择性的浓缩,特别是当样本包括大量的PCR抑制剂时。用核苷酸提取方法能够避免培养,核苷酸提取方法产生了PCR所需一定质量的DNA并且优化了PCR反应。如果在大量样本中检测少量的病原体,或者病原有机体在PCR灵敏度的极限以下的情况下,将需要使用培养。在一般情况下,使用培养的情况是很少的。去除了培养的步骤,时间将被节省下来。比节省时间更重要的是,去除了培养,那些难以或不能培养的生物体就可以进行检测。这些生物体包括某种病毒、真菌、厌氧性生物和支原体。

第三,PCR的花费合理。与培养或抗体基础的化验相比,PCR基础的诊断是十分经济的。考虑到细菌的培养,有较昂贵的花费。大多数样本为了正确的鉴定需要培养和重复培养,这需要大量的手工时间(加上化验的花费),也增加了污染的危险。

作为比较,大多数抗体化验所需的手工时间很少但化验本身很昂贵。 PCR反应的成分(引物,酶,dNTPs和缓冲液)的花费比每次化验的花费少40%,而反应的时间包括核苷酸分离,通常在一小时以内。当然这依赖于样本、技术员和用于分离核苷酸的技术。既然PCR所用的时间少,它的花费也少。但是,PCR需要热循环,UV来源和一些类型的图象捕获装置,因此PCR实验室的最初花费比较高。

我们再讨论另外一些PCR在临床领域使用的基本原理
  
第一, PCR不是抗原基础的。
  
抗体基础的检测工具(ELISA和其他)不仅检测直接抗病原体的人类抗体,而且能检测病原体上的表面抗原。人类抗体检测工具因此需要免疫反应的存在,以及在正确检测抗原存在之前抗体浓度的测定。在新近感染的情况下,这种测试不能检测针对病原体的人类抗体,可能不能正确反映是否有感染。事实上,被感染的病人,没有充足的时间来提高用于检测的浓度,这是HIV抗体基础检测的通常的问题。由于相同的原因,这种类型的测试对检测无免疫应答患者的病原体存在困难。反过来讲,抗体基础的测试也会给出错误相反的结果。

然而抗体基础的检测最大的问题是它不能检测新的病原体亚型,由于表面抗原发生改变,而导致了错误的阴性结果。PCR基础的检验也可能由于DNA的变化、突变而遇到相似的问题,但PCR基础的检验能够进行设计,使这些错误的阴性结果最小化。尽管有这些缺点,抗原基础的检测工具是十分重要的检测方法,在大多数情况下比PCR检测要迅速。
  
第二, 检验易按客户的要求设置,以适合特殊的需要。
  
通过简单使用不同的特殊目标引物,工具能迅速设计,用于许多检测。
  
第三, PCR容易使用,是由时间证实的技术。
  
通过使用有商业价值的核苷酸提取产物,用于病原体检测的样本能在少于十分钟的时间内被例行操作。一旦进行操作,样本被加入反应体系中,进入热循环。反应完成后,样本能被自动系统或凝胶电泳所分析。少数的PCR检测将能完全自动化。仪器将进行所有操作,从样品的准备到分析结果。这样的系统将十分昂贵,可能只能适应制造商的平台。这对大多数临床实验室无吸引力,但当价格下降后,将最终使PCR诊断自动化。


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