在许多反转录病毒中与多功能酶的反转录酶有关，在病毒基因组进入DNA转录的不同阶段执行重要的功能。在真细菌中，核糖核酸酶H确信在以下方面是所必需的：从Okazaki片段去除RNA引物时、在转录子进入DNA聚合酶I启动DNA合成所用引物的转录过程时，以及在去除R-环为在大肠杆菌染色体复制起点提供不规则DNA合成的条件性启始位点。在真核细胞中核糖核酸酶H也可能执行类似的功能。

已有报告讲核糖核酸酶H可明显增加反义寡脱氧核糖核酸对基因表达的抑制。这些寡核苷酸和mRNA中的特定序列的杂合子对此酶的降解敏感。核糖核酸酶H在体外起动对在Colicin E1( pColE1)型质粒的原始部位(Ori)的复制是必须的。此酶似乎也抑制启动非Ori部位的DNA合成。

X射线晶体成像分析显示：大肠杆菌核糖核酸酶H含有两个功能区；其中一个含Mg2+结合位点，与一种前不久在DNA酶I被认识的折叠β链吻合。