循环肿瘤细胞检测如何实现即时个体化医疗？
恶性肿瘤的高度异质性使不同个体之间存在药效的差异，给临床诊治造成了很大困扰。人类基因组学、药物基因组学与肿瘤生物学研究成果的涌现，推动了肿瘤个体化医疗模式的兴起与快速发展。它提倡先检测与药效相关的基因或生物标志物，实现对肿瘤的分子分型，从而选择适合特定个体的药物，提高药物疗效及降低不良反应。目前，临床上一般通过手术切除或穿刺活检得到肿瘤组织来进行分子分型，创伤性大，取材的次数受限。
外周血中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是指由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，可作为肿瘤代表性的“液体活检”样本，允许非侵入性、多次、实时获取。CTCs的监测在肿瘤的实时个体化治疗中具有独特的优势。
一、循环肿瘤细胞的检测方法
1．分离方法：
分离是将CTCs与血细胞分开并富集的过程。伴随着现代科技的发展，根据CTCs的生物学特性及其体积、密度、电荷和变形性等物理特征，已有多种技术应用于CTCs的分离。其中，基于生物学特性的方法主要是运用免疫学原理，利用CD45、CDl4等白细胞特异性表面抗原来去除白细胞(负性分选)或用上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor·2，HER-2)等抗体进行细胞富集(正性分选)。Ce|lSearch系统是一个经典的正性分选方法，其原理是先用EpCAM抗体标识的微磁珠从全血中捕获细胞，然后用免疫荧光识别EpCAM CK CD45一DAPI 细胞(被定义为CTC)来进行磁性分离。正性分选的CTCs纯度高，但目前分选方法大多基于上皮标志物，CTCs可能因上皮一闻质转化(epithelial—mesenchymaltransition，EMT)丢失这些分子，导致具有间质表型的CTCs无法被富集；而且有些非上皮来源肿瘤、抗原表达减弱、被血小板包被等肿瘤细胞易漏检；良性上皮循环细胞会引起假阳性。由于CTCs表面抗原性质的复杂性，制约了基于抗原的分离方法的效果。
目前，非抗原依赖性的分离方法受到了关注。密度梯度离心是根据各种细胞密度不同来进行离心分层，但不能有效区分CTCs与单个核细胞。膜过滤法是利用上皮肿瘤细胞体积比白细胞大的特点来分离，对细胞损伤少，能保持细胞的形态与活性用于后续的细胞培养与分型鉴定，也能进行化疗或放疗敏感性分析；但部分白细胞会在膜上残留，部分小CTCs易丢失。介电电泳分选是在微流控芯片外加一个不均一的电场，对介电特性不同的细胞进行迁移分离，特异性高，能较好的保持细胞的活性。
CTCs在血中含量稀少，只有1．43％的进展期乳腺癌患者含兰500个CTCs／7．5 ml血液。其有效分离是后续分析与准确检测的关键前提，也是目前关注的焦点。为了充分发挥不同分离技术的优势，提高方法的敏感性和特异性，实际的CTCs分离设备往往整合多种技术于一体。美国麻省总医院研制了一种融合了微流控分离芯片、磁电泳与白细胞去除等技术的非抗原依赖的CTCs分离装置，消除了EMT表型变化的困扰，提高了分离速度、效率与收获肿瘤细胞的纯度，而且能保持细胞的形态与性质，便于后续的分型分析。
2．分析方法：
对分离出来的CTCs可进行基因型、表型分析与功能鉴定。FISH技术可用于检测CTCs的基因扩增(如HER．2)与基因重排(如ALK)的情况等，RT—PCR和芯片方法用于检测肿瘤细胞中高表达的mRNA(如CKl8、CKl9、PSA、MUCl)或突变性质的基因(如KRAS、EGFR、PIK3CA)，从而反应CTCs的数量、活力以及功能；单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术，目前已被用于分析CTCs的基因突变与基因组异常分析等。CTCs的表型分析主要通过利用免疫荧光方法检测CK8／18／19、CD45、DAPI、HER一2等标志物来进行。上皮免疫斑点法通过检测细胞在短时间培养中分泌、脱落或释放的蛋白质，对有功能活性的CTCs进行评估。
二、循环肿瘤细胞监测在肿瘤实时个体化医疗中的临床应用
1．预后预测：
CTCs在健康人和良性疾病患者血液中几乎检测不到，在肿瘤早期的患者血液中含量极低，但在肿瘤进展到晚期后其计算显著升高。治疗前血液中CTCs的基线水平，已被认为是转移性乳腺癌、结肠癌和前列腺癌患者的一种可靠的独立预后指标。与外周血<5个CTCs／7．5 ml的乳腺癌患者相比，治疗前血液中至5个CTCs的患者的无进展存活时间与总生存时间均显著缩短。而且CTCs也能早期预测肺癌、胃癌等患者的预后与化疗效果。但CTCs在患者预后预测的临床应用依赖于检测方法的完善及预测标准的建立。
2．个体化药物选择：
CTCs具有与肿瘤原发灶相似的基因型和表型。目前，国际上越来越侧重于研究CTCs的分子分型对靶向药物治疗的指导价值，从而摆脱目前单纯依靠肿瘤组织诊治的窘境。HER．2单抗赫塞汀(Herceptin)对HER一2阳性的乳腺癌具有显著疗效。研究显示，大部分乳腺癌CTCs的HER一2表达与原发肿瘤组织一致，这意味着可依据CTCs来指导乳腺癌靶向药物Herceptin的治疗。而且CTCs的雌激素受体和孕激素受体检测也能指导乳腺癌的内分泌治疗。肿瘤EGFR的突变被证实是酪氨酸激酶抑制剂(如吉非替尼)等靶向药物对非小细胞肺癌患者疗效的预测指标。研究发现，非小细胞肺癌患者CTCs的EGFR突变情况与肿瘤组织也具有高度一致性。检测患者外周血CTCs的EGFR突变情况可预测患者对酪氨酸激酶抑制剂的临床疗效，避免耐药性的产生。
肿瘤细胞的进化可使转移灶表型与原发灶产生差别，而且CTCs的药物靶向标志物也有时与原发灶不一致。HER-2阳性的乳腺癌患者经抗HER．2药物治疗后，CTCs为HER-2阳性的患者的无进展生存期比CTCs为HER．2阴性的患者要长。小部分原发乳腺癌组织为HER一2阴性的患者，在治疗过程中检测到CTCs的HER-2转为阳性，在使用Herceptin治疗后，也取得了较好的疗效。这说明在实时个体化治疗中，直接检测CTCs药物靶标的表达来指导药物治疗方案制定甚至优于检测原发肿瘤组织，更能反映具有转移潜质的肿瘤细胞特征。
3.实时药物疗效评估：
转移性乳腺癌、结肠癌和前列腺癌患者经抗癌治疗有效后，CTCs计数常由高降低。而CTCs计数经治疗后从低升高，常预示肿瘤患者疗效欠佳，病情恶化，生存期减短。比较肿瘤患者治疗前后的CTCs计数变化，能反馈患者的疗效情况，从而制定更明确的治疗方案。
EMT可使CTCs获得干细胞特性，而具有药物耐受性和高侵袭性。据一项研究报道，侵袭性强的乳腺癌类型的患者血液标本中，以间质性表型CTCs为主；在接受治疗后，产生疗效的患者的CTCs数量与／或间质型比例明显下降，而病情恶化的患者的间质型CTCs计数明显增多。在对指定患者治疗过程中CTCs动态监测中，肿瘤患者初始对相应靶向药物疗效较好，CTCs数量明显降低并以上皮型为主；经7个月治疗后出现了耐药性及病情进展，间质型CTCs升高；然后更换治疗方案为标准化疗，患者病情好转，CTCs数目再次降低并以上皮型为主；3个月后，患者病情再次恶化，CTCs以间质型为主。这说明患者CTCs数量、EMT表型与药物疗效或耐药情况密切相关。因此，肿瘤治疗过程中实时监测CTCs的数量和相关分子标志物、EMT表型等分子特征，能有效反映患者的药效动态信息及疾病状况，从而有效地指导患者的个体化治疗。
三、展望
目前，CellSearch系统是惟一经FDA批准进入临床应用的CTCs检测方案。但外周血中CTCs的含量稀少、异质性、CTCs细胞团在微小毛细血管中的滞留等因素，给其有效分离与准确检测造成了极大的困难。现行的CTCs的分离方法大多基于上皮抗原，这些上皮抗原在EMT表型改变和一些侵袭性强的肿瘤细胞表面常发生丢失或减弱，而被漏检。建立捕获这些与肿瘤转移相关的细胞亚群的有效方法，非常必要。而且绝大多数的分离方法不能获得有活性的CTCs，用于后续的转移潜能、侵袭性和药物敏感性等生物学功能分析。现有的分离与检测方法的这些局限性，严重制约了CTCs在临床治疗中的应用，迫切需要进一步的改进与完善。
令人庆幸的是，目前越来越多的高新技术逐渐渗透于CTCs的分离与分析，使新研发的方法与设备功能更强，性能与检测效果更好。单细胞全基因测序技术及单细胞基因组学可解决血液CTCs数量稀少的难题，能检测更多药效相关基因及分析耐药机制，为CTCs的分子分型及靶向药物治疗提供更准确的信息。相信未来CTCs检测技术的逐步改善与规范，将会给肿瘤患者带来更大的希望。
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