细胞破碎和蛋白质溶解实验_匀浆法
为了纯化细胞蛋白质，采用有效的方法进行细胞破碎和固液分离是必要的。它是全过程的第一步，通常是将处于细胞不同位置的待纯化蛋白释放出来，溶入已知成分的溶液内。该步骤是目的蛋白初级分离纯化阶段的重要环节，它直接影响产物的回收率，也可能影响产物的纯度。
| 实验方法原理 | 通过固体剪切力破碎组织和细胞，释放蛋白进入溶液。市售的匀浆器主要有四类，刀片式组织破碎匀浆器、内切式组织匀浆器、玻璃匀浆器和用于规模生产的髙压匀浆器。玻璃匀浆器的匀浆头（杵）有玻璃制的，也有特夫隆制的，既可以手动也可以电动。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法，是实验室首先考虑的方法之一。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 用组织剪或芋术刀迅速将清洗的组织分离成适宜的小块，如 1 cm3； 2. 每体积湿重组织通常加 3～5 倍体积预冷的匀浆缓冲液至匀浆容器内； 3. 制备匀浆 ： 3.1 电力驱动的玻璃匀浆器以 500～1500 r／min 的速度，匀浆 3～6 次，每次 5～10 s 。 3.2 手动玻璃匀浆器匀浆 10 ～20 次。 3.3 刀片式组织破碎匀浆器和内切式组织匀浆器以 1000～3000 r／min 的速度，高速匀浆 3 次 ，每次 20～30 s，次间暂停几秒。 展开 |
| 注意事项 | 1. 玻璃匀浆器杵和臼之间的空隙应为 0.35～0.70 mm。 电动玻璃匀浆器常用于匀桨肝、心、肌肉等软组织的匀浆；手动玻璃匀浆器常用于培养细胞和脑组织等的匀浆。 2. 匀浆过程应注意维持低温。玻璃匀浆器可外置冰水浴，其他匀浆容器可预冷或在冷室内匀浆。 3. 匀浆时所霈匀浆缓冲液的体积在不同条件下可有很大差别，有时甚至可为湿重组织体积的 9～10 倍。 4. 匀浆的效果可以用相差显微镜观察组织细胞状况评估，也可定量单位湿重组织释放的蛋白质含量监控。 展开 |
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