带屏障装置的自动移液器吸头 微型离心管酶 可调式移液器 可按所需扩增条件设定程序的热循环仪

材料




缓冲液和溶液

贮存液，缓冲液的成分及所需试剂请见附录 1。
将贮存液稀释释到适当的浓度。

10x 扩增缓冲液
含有四种 dNTP 的混合溶液，每种 dNTP 浓度为 20 mmol/L。

酶和缓冲液

热稳定 DNA 聚合酶
为了避免碱基的错误掺入，在重叠延伸诱变反应中应使用带 3'—5'外切核酸酶校对能力的髙效热稳定 DNA 聚合酶。另外. 使用的 DNA 聚合酶一定不能具有催化非模板性掺入腺苷酸残基的能力。具备此种特性的 DNA 聚合酶包括 Puo DNA 聚合酶 (Boehringer Mannheim),rTth DNA 聚合酶 XL(Pwkin Elmer)。VentR DNA 聚合酶（New England Biolabs) 和 Pfu DNA 聚合酶 (Stmagene)。
为长片段 PCR 反应所设计的热稳定 DNA 聚合酶混合物也适用于重叠延伸诱变反应。

凝胶

含 0.5ug/ml 溴化乙锭的琼脂糖凝胶（1%) 或聚丙烯酰胺凝胶
请见步骤 6 和 11。

核酸和核苷酸

寡核苷酸引物
每种引物的长度应为 20~30 个核苷酸. 含有大致相同数量的四种碱基，G 和 C 残基的分布应均匀，较低的形成稳定二级结构倾向。诱变引物 FM 和 RM 之间至少有 15 个碱基的重叠序列（请见图 13-4), 错配碱基应位于引物序列的中部。在扩增 DNA 片段的 3'和 5'端引物（即具有野生型序列 R2 和 F2 引物）可以设置单一的限制性酶切位点，以便于后续步骤中诱变 DNA 片段的克隆。引物设计的一般原则，请见第 10 章中导言部分关于核苷酸引物的设计。
在 DNA 自动合成仪上合成的寡核苷酸引物一般不需要纯化，可直接用在重叠诱变中。

模板 DNA
诱变中使用的模板通常是含感兴趣的基因或 cDNA 的质粒 DNA。将 DNA 以 1ug/ml 的浓度溶解在含低浓度 EDTA(<0.1 mmol/L) 的 10mmol/L Tris-Cl(pH7.6) 的溶液中。

专用设备

带屏障装置的自动移液器吸头

微型离心管（0.5 ml 扩增用薄壁管）

可调式移液器

可按所需扩增条件设定程序的热循环仪
如果热循环仪不配备加热盖装置，使用矿物油或石蜡油以防止 PCR 过程中反应混合物液体的挥发。

其他试剂

本方案步骤 11 需要的试剂列在第 1 章方案 17 或 19 中。
本方案步骤 12 需要的试剂列在第 12 章方案 3,4 或 5 中。

方法

1. 依据材料和方法中的要求和已知 DNA 序列设计合成寡核苷酸引物 FM,RM,R2 和 F2。

2. 在一个 0.5 ml 的微量离心管或扩增管中混合以下试剂，组成 PCR 反应 1。

模板 DNA                                                      约 100ng
10x 扩增缓冲液                                             10ul
20 mmol/L4 种 dNTP 混合溶液                      1.0ul
5umol/L 引物 FM(30pmoles)                          6.0ul
5umol/L 引物 R2(30pmoles)                           6.0ul
热稳定 DMA 聚合酶                                        1~2 单位
加水至 100ul

3. 在第二个微量离心管或扩增管中混合以下试剂，组成 PCR 反应 2。

模板 DNA                                                         约 100ng
10x 扩增缓冲液                                               10ul
20 mmol/L4 种 dNTP 混合溶液                        1.0ul
5umol/L 引物 RM(30pmoles)                            6.0ul
5umol/L 引物 F2(30pmoles)                             6.0ul
热稳定 DNA 聚合酶                                          1~2 单位
加水至 100ul

4. 如果热循环仪没有加热盖，用一滴石蜡油（约 50ul) 覆盖 PCR 反应液。将反应管置于热循环仪中。

5. 用下表中给出的变性、退火、聚合所需的时间和温度扩增 DNA 片段。


上述反应条件适合于 0.5 ml 薄壁管和 100ul 反应体积，以及 Perkin-Elmer 9600、9700,Master Cycler(Eppendorf) 或 PTC 100(MJ Research) 热循环仪。使用其他类型的仪器或不同的反应体积时需调整上述反应条件。
聚合反应所需的时间应通过计算热稳定 DNA 聚合酶的聚合效率及 DNA 模板长度来获得。
应根据诱变引物序列调节退火反应的溫度。

6. 各取以上两组 PCR 反应产物的 5% 进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳估计扩增靶 DNA 的浓度。

7. 用第 5 章中描述的方法之一纯化以上两组 PCR 产物。对产物进行纯化往往增加步骤 8 中所希望的扩增产物的产量。并可降低错误扩增产物的背景。（选做）

8. 在一个灭菌的 0.5 ml 的微量离心管或扩增管中混合以下试剂进行扩增反应，连接靶基因的 5'和 3'端。

PCR1 扩增产物（步骤 2)                                       约 50ng
PCR2 扩增产物（步骤 3)                                       约 50ng
10x 扩增缓冲液                                                     10ul
5umol/L 引物 F2(知 pmoles)                                  6.0ul
5umol/L 引物 R2(30pmoles)                                   6.0ul
热稳定 DNA 聚合酶                                                1~2 单位
加水至 100ul

9. 如果热循环仪没有加热盖，用一滴轻石蜡油（约 50ul) 覆盖 PCR 反应液。将反应管置于热循环仪中。

10. 用步骤 5 给出的变性、退火、聚合反应所需的时间和温度进行扩增。

11. 取 PCR 反应产物的 5% 进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳估计扩增的靶 DNA 浓度。
如果引物 F2 和 R2 序列中加进了限制酶切位点，用这些限制酶消化扩增的 DNA, 然后把它们亚克隆至适当的栽体。也可以将步骤 10 扩增的 DNA 片段磷酸化，然后连接到用限制酶切割成钝端的载体中。

12. 克隆后确证扩增 DNA 片段的全序列，保证在操作过程中没有产生除引物 FM 和 RM 携带突变之外的其他突变。
所有 DNA 聚合酶在体外反应中都显示出可测量的错误掺入率。