二级菌种和三级菌种培养基装瓶（袋）后，应及时灭菌，以防止培养料酸败。灭菌是杀死培养料中杂菌、控制接种后菌种污染以及保证接种成功率的关键措施之一。一般采用常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌两种方法。

1．常压蒸汽灭菌常压蒸汽灭菌要求温度达到100℃以后，一般维持8～12h，方可达到灭菌要求。灭菌所需时间，也应根据培养基原料的种类和颗粒大小来决定。采用木屑、棉籽壳、蔗渣、稻草、玉米芯、花生壳为主料的培养基需连续灭菌8～10h；粪草培养基、枝条培养基和谷粒培养基需连续灭菌12h。一般停火后再焖蒸2～3h，培养料出锅后，运至接种室冷却后，备用。

2．高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌效率高，当锅内温度升高到120℃以上，在很短的时间内就能杀死一切微生物及其芽孢。菌种瓶（袋）在0. 14MPa、128℃条件下保持1.5～2h即可达到灭菌的目的，灭菌结束后，待锅内压力降至零后开盖取出灭菌物，运至接种室冷却后，备用。

高压蒸汽灭菌适用于玻璃瓶以及耐高压的聚丙烯袋，而用聚乙烯塑料袋装料的，因聚乙烯塑料袋耐压和耐温性能差，不能采用高压灭菌。灭菌前，菌种瓶（袋）的摆放要留有空隙以利于蒸汽流通。在灭菌过程中，应注意排净锅内冷空气，锅内冷空气如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的。

3．灭菌效果的检验培养料灭菌的效果，直接影响二级菌种和三级菌种成品率的高低。因此不但要把好灭菌关，而且还要对灭菌物品进行严格检验。

把灭菌后的菌种瓶（袋）按灭菌锅内的不同位置，每处抽取数瓶（袋），置于25～30℃培养室培养一周，进行检查。如果所有被检测培养料都没有杂菌生长，说明灭菌彻底；如果大部分或全部菌种瓶（袋）都出现杂菌，说明灭菌不合格。