western blot印迹膜均匀高背景产生原因及解决方案
Westerns blot是分析蛋白表达的有力技术。通过这种测定方法，可以评估单个蛋白的分子量，翻译后修饰蛋白和蛋白表达丰度。 蛋白印迹相对简单，不需要昂贵的设备或试剂，使其成为许多实验室蛋白检测方法。
成功的western blot的关键是使用与单一蛋白特异性反应并且与其他蛋白几乎没有交叉反应性的抗体。 成功的western blot还依赖于获得信号：信噪比，其允许以最小背景检测蛋白。均匀高背景和不均匀斑点背景是Western blot中的常见问题。 下面描述Western blot中产生高背景的常见原因和解决方案。
均匀的高背景
均匀的高背景是使整个印迹变暗的背景，使得难以看到特定的条带。均匀背景可能由多种原因造成。
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抗体浓度过高
如果使用过高浓度的抗体，它们可能与印迹膜发生非特异性结合。 这将导致整个印迹的均匀高背景。 当使用超敏化学发光（ECL）时，有时噪音点甚至会在黑暗中发光。
解决方案
滴定抗体
为了降低由于高抗体浓度导致的高背景，需要滴定抗体，滴定一抗和二抗浓度。
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封闭不足
封闭膜是阻止抗体与膜非特异性结合的关键步骤。 通过在合适的封闭缓冲液中孵育印迹来实现充分的封闭。 封闭剂的类型，孵育的时间和温度可影响封闭效率。
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封闭试剂
封闭试剂的选择取决于特定的抗原：抗体相互作用，并且最好根据经验确定。
脱脂奶粉是常用的封闭液。 通常建议使用5％的牛奶来封闭，但有时这种高浓度牛奶会掩盖被检测的蛋白，特别是如果表达量低的情况下。 我们建议从1％牛奶开始。
牛奶可能与某些抗体和检测系统不相容，在这种情况下，3％牛血清白蛋白（BSA）是可以使用的第二种基于蛋白质的封闭试剂。
一些公司销售无蛋白封闭试剂， 不含蛋白的试剂可防止干扰，但也可与蛋白类封闭液联合使用，以增加封闭能力。
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孵化的时间和温度
在室温下通过摇床封闭孵育1小时或在4℃下搅拌孵育过夜进行封闭。
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来自不兼容的封闭剂干扰
当封闭剂与抗体相互作用引起干扰时，可以观察到均匀的高背景。 例如，抗体可以与基于蛋白质的封闭剂中的蛋白质结合并导致高度均匀的背景。含有未纯化的一抗动物血清可以与封闭试剂中的动物蛋白结合。 此外，脱脂奶粉可以与某些抗体或检测试剂发生特异性反应。牛奶中含有酪蛋白，一种可与磷酸特异性抗体反应的磷蛋白。 牛奶还含有可变量的抗生物素蛋白，可以干扰抗生物素蛋白 -生物素检测系统。 这两种相互作用都会产生高度均匀的背景。
解决方案
测试不同的封闭剂
应确定每种抗原：抗体组合的适当封闭试剂。 如上所述，两种最常见的封闭剂是脱脂奶粉和牛血清白蛋白。 如果这些封闭剂都不合适，则可以使用无蛋白或非动物蛋白质封闭试剂，例如Azure Protein-Free Blot Blocking Buffer是一种无蛋白封闭溶液，针对荧光印迹进行了优化。它还可作为化学发光蛋白印迹的优异封闭试剂。
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漂洗不足
在与一抗和二抗孵育后充分漂洗印迹以去除过量抗体是重要的。 漂洗不良会导致背景不均匀。
解决方案
改变漂洗体积，时间和漂洗次数
增大漂洗液用量， 推荐的方案是在每次孵育后漂洗膜3次，每次漂洗5分钟。 可以增加洗涤次数和洗涤时间以提高洗涤效率； 然而，过量漂洗会降低信号强度。
