海洋被子植物Zostera marina的PSI中依赖于NDH高效的环式...-3

PSI循环电子流的动态变化

以ETRI-ERTII为代表的PSI-CEF的活性在三个水平的照射下逐渐增加。同样，P700+再诱导所示的PSI-CEF活性也随着光强的升高而逐渐升高。这些结果表明，大叶藻PSI-CEF随着光照时间的延长逐渐增强，同时也会随着光照强度的增强而增强。
 

图2 在LL（50μmolm-2s – 1 黑色圆形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）处理条件下ETRI-ETRII随时间的变化过程。平均值±SD由四个独立样本计算。采用Tukey趋势检验，差异有统计学意义(P < 0.05)
 

图3 a在LL（50μmolm-2s – 1 黑色圆形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）处理条件下P700+再还原半衰期随时间的变化过程。平均值±SD由四个独立样本计算。每个点表示对指数函数的拟合（所有R2值＞0.96）

两个PSI循环电子途径的动态变化

利用光照后叶绿素荧光的瞬时增强来测定NDH依赖的PSI-CEF。如图4a所示，叶绿素荧光在光照后出现了明显的瞬时增强，且这种增强在HL条件下大于ML大于LL光照处理。此外，光照后的初始斜率随着曝光时间的增加而逐渐增大(图4c)，说明NDH依赖的PSI-CEF被显著激活。为了确定处理过量照射的两个PSI-CEF通路的持续响应，我们使用从Z. marina叶子中分离的叶绿体，使用特异性抗体进行免疫印迹分析。针对NdhH亚基的抗体只能识别45kDa的一个多肽，而抗NdhS的抗体只能识别27-kda的一个蛋白。每个样本中，anti-PGR5识别一个15-kda蛋白，anti-PGRL1识别一个29-kda蛋白（图5）。光密度分析显示，NdhH和NdhS蛋白水平所描述的ndh依赖通路活性明显随暴露时间的延长而逐渐增加。相比之下，由PGR5和PGRL1蛋白水平表达的PGR5/L1相关的通路活性在光照开始后的早期最高，随后下降到稳定水平(图5b)，表明PGR5 /l1依赖和nndh依赖的PSI-CEF通路可能在不同的光照期交替作用。

图4 a一种监测NDH活性的经典叶绿素荧光追踪，b在LL（50μmolm-2 s– 1 黑色圆形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）条件下照射3h后鼓包的响应。b在LL（50μmolm-2 s– 1 黑色圆形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）条件下鼓包的初始斜率随时间的变化过程。平均值±SD由四个独立样本计算。采用T检验，差异有统计学意义(P < 0.05)
 

图5 采用特异性抗体Western blot法分析四种具有代表性的PSI-CEF蛋白含量RbcL,NdhH, NdhS, PGR5, 和PGRL1蛋白表达水平在HL下随时间的变化过程。一个稀释系列（0h 深色；3.75、7.5和15μg叶绿素对应于25、50和100%的0 h黑暗的样本）的Z. marina的叶绿体蛋白放在了1-3道。多肽的分子质量显示在边缘上。b通过视频密度分析NdhH(灰色网格条)、NdhS(浅灰色条)、PGR5(深灰色条)和PGRLI(黑色条)的化学发光条带。平均值±SD由三个独立样本计算。不同字母表示差异有统计学意义(P < 0.05，单因素方差分析)。

循环电子流对ΔpH的贡献

通过P515来测量电致变色效应，用于评估ΔpH（图6），初始过渡在20分钟后趋于平稳(图6 b)。在AA 和鱼藤酮处理下△pH的降低幅度相似，这表明这两个通路对PSI-CEF有相似的贡献。值得注意的是在△pH除了前期略有升高之外，鱼藤酮处理能抑制△pH的增加（图6）。P515关光响应的初始速率gH+可以被看作是照明过程中H+流出速率的度量，它是ATP-ase的质子电导率的函数。在这里,gH+随暴露时间逐渐减少，这与∆pH呈现一个此消彼长的关系。PSI-CEF抑制剂处理后，gH+在初始阶段没有明显变化，而gH+在20 - 30min内显著下调，说明PSI-CEF对ATP合成的贡献主要是在后期光照期间（图6b）。

图6 a 记录经过水（黑色三角形）、AA（灰色圆形）和鱼藤酮（白色三角形）处理后暗-光和光-暗诱导P515缓慢变化对30min HL的响应。每条曲线基于4次重复的平均值。经过水（黑色圆形，淡灰色柱状图）、AA（黑色方形，灰色柱状图）和鱼藤酮（黑色三角形，深灰色柱状图）处理后，△pH（线状）gH+（柱状）对HL随时间的变化。平均值±标准差由四个独立样本计算。不同的字母有显著差异(P < 0.05，单因素方差分析)。

NDH依赖性PSI- CEF与PSII活性的关系

为了确定过量光照射下的OEC蛋白水平，使用特异性抗体从对OEC的三个外周蛋白进行免疫印迹分析。抗PsbO亚基(anti-PsbO)的抗体只能识别33 kDa的一个多肽，而抗psbp和抗PsbQ的抗体则分别识别23 kDa和24 kDa的蛋白(图7a)。光密度分析显示，HL暴露后PsbO和PsbP蛋白水平明显下降，而PsbQ未见明显变化(图7b)。

图7 a采用免疫印迹法在高光(600μmol m−2 s-1)和对照照射180分钟条件下分析了三种具有代表性的OEC的蛋白含量。为了检测各自的信号，使用一个稀释系列(0 h黑暗；3.75、7.5和15μg的叶绿素含量对应于25，50和100%的0 h黑暗样本)的Z. marina叶绿体蛋白放置于1-3行。多肽的分子质量显示在边缘上。b在对照（暗灰柱）和HL处理下照射180min采用视频密度分析化学发光条带。平均值±SD由三个独立样本计算。不同字母表示差异有统计学意义(P < 0.05，单因素方差分析)