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RNA干扰实验技术介绍(一)

2020.6.01

通过生化和遗传学研究表明,RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段,加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明;一个称为Dicer的酶是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员,它能以一种ATP依赖方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链RNA,切割将RNA降 解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs),每个片段的3’端都有2个碱基突出。

在RNAi效应阶段,siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencingcomplex, RISC)。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,并在距离 siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了,但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。

另外,还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默。

实验步骤

1. siRNA的设计

1) 在设计RNAi实验时,可以先在以下网站进行目标序列的筛选:

2) RNAi目标序列的选取原则:

A.从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始,寻找“AA”二连序列,并记下其3'端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示 GC含量在45%-55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区(untranslated regions,UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结 合mRNA从而影响siRNA的效果。

B. 将潜在序列和相应的基因组数据库(人,或者小鼠,大鼠等)进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。

C. 选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,以找到最有效的siRNA序列。

3) 阴性对照

一个完整的siRNA实验应该有阴性对照,作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性。通常做法是将选中的siRNA序列打乱,同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。

4) 目前已证实的siRNA可以在下面的网页找到:

2. siRNA的制备

目前为止较为常用的方法有通过化学合成,体外转录,长片断dsRNAs经RNase III 类降解体外制备siRNA,以及通过siRNA表达载体或者病毒载体,PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。

1) 体外制备

A. 化学合成

许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成3-4对siRNAs 的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素

B. 体外转录

以DNA Oligo为模版,通过体外转录合成siRNAs,成本相对化学合成法而言比较低,而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受 到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当 的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小,稳定性好,效率高,只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达 到的效果,从而使转染效率更高。

最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。

不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。长期研究。

C. 用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA

其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs“混 合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ,然后用RNaseIII (or Dicer) 在体外消化,得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后,这个siRNA混合物就可以直接转染细胞,方法和单一的siRNA转 染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。


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