膜蛋白的分离、鉴定及其功能分析—GFC/IEC/SDS-PAGE ...（二）
2. GFC/AEC/SDS-PAGE Separation
分离复杂的蛋白质混合物，如膜粗提物，需要两个连续的色谱层析步骤。因此，必须获得较大量（约 5 mg) 的增溶蛋白质样品。这也有利于低丰度的蛋白质在 SDS-PAGE 电泳泳道上被分辨出来。由于分子筛色谱层析（GFC) 会稀释样品，因此它被用在第一步的色谱层析，经 GFC 层析后被稀释的样品经第二步的离子交换层析（IEC ) 后得到浓缩。下面介绍的是，拟南芥膜增溶蛋白用 Superdex 200 Highload 16/60 层析柱进行的 GFC 色谱层析实验（见注释 5) 。
( 1 ) 用 180 ml 洗脱缓冲液，1 ml/min 流速，室温下平衡 GFC 层析柱。
( 2 ) 将新增溶的蛋白质样品进样到层析柱上。
( 3 ) 用 180 ml 洗脱缓冲液洗脱蛋白（0.5 ml/min) ，并设置 0.3 ml 的收集组分容积。
( 4 ) 将邻近组分中蛋白质含量低于 500 μg ( 根据 280 nm 吸收估计的量）的组分合并在一起（见注释 6) 。
( 5 ) 取 100 μg GFC 分离组分样品，加入冷丙酮 [ -20°C，80% (V/V)] ，于 -20°C 下过夜，用以沉淀蛋白质。
( 6 ) 用微量离心机 4°C 下 17000 g 离心 30 min。
( 7 ) 在上述用丙酮沉淀的蛋白质样品中加入 50 μl Laemmli 样品缓冲液，涡旋振荡，并超声波振荡处理（超声波水浴中处理 15 min) ，重悬沉淀的蛋白质。
( 8 ) 按前述方法用 SDS-PAGE 分离 GFC 洗脱组分的蛋白质。
( 9 ) 按前述方法将上述的 GFC 分离出来的组分样品（至少含 500 μg 的蛋白质）进行第二步 AEC 色谱层析，使用 Mono Q HR 5/5 ( Pharmacia/Amersham Biosciences 公司）。
膜粗提物经 GFC/SDS-PAGE 分离后，得到较为复杂的蛋白图谱，特别是在 40~70 kDa 区域内（图 22-4)。当经过 GFC/AEC/SDSPAGE 分离后，可得到较为简单的蛋白质图谱（图 22-5)，易于用 MALDI-TOF/MS 鉴定蛋白质（切下的蛋白质条带含较少的蛋白质)。
3.4 胰蛋白酶胶内蛋白消化
( 1 ) 切下考马斯亮蓝染色的条带。
( 2 ) 用 2 ml ( 在 2 ml 离心管中）洗胶液充分冲洗切下来的胶粒至完全褪色，一般来说，两次 4 h 的脱色冲洗可完全脱去胶粒的颜色。
( 3 ) 将褪色的胶粒在纯乙腈溶液中脱水处理 1 h。
( 4 ) 用真空干燥器完全干燥胶粒（30 min)。
( 5 ) 4°C 条件下，用消化缓冲液制备新鲜的胰蛋白酶溶液（0.02 μg/μl)，防止酶的自身消化，置冰上备用。
( 6 ) 将干燥的胶粒置于小离心管中，滴入 15 μl 的胰蛋白酶溶液，将管子插入冰中，水化胶粒。30 min 后，胶粒上只有薄薄的一层胰蛋白酶溶液。当初始加入的胰蛋白酶液滴被胶粒完全吸收后，加入 15 mmol/L 碳酸氢铵缓冲液，使胶粒周围包裹一层薄薄的碳酸氢铵。如果初始加入的胰蛋白酶溶液未被胶粒完全吸收，吸出多余的胰蛋白酶溶液，使胶粒周围只有一层薄薄的胰蛋白酶（见注释 7) 。
( 7 ) 将装有胶粒的离心管封口，37°C 至少保温 5 h，也可保温过夜。
( 8 ) 加入 150 μl 肽段萃取缓冲液，20°C 保温 3 h。
( 9 ) 去掉胶粒，用真空干燥器将 500 μl 离心管中的肽段萃取液浓缩至 5 μl。千万不要将肽段萃取液完全干燥，因为那样会使肽段吸附在管壁上而洗不下来。
3.5 MALDI-TOF/MS
在本书介绍的通用步骤（见第 19 章）之后，蛋白质将在靶上结晶，这里简单阐述如下：
( 1 ) 用半饱和的 1:1 乙腈/水溶液新鲜配制 α-氰基-4-羟基肉桂酸，并用 0.1% TFA 酸化。
( 2 ) 将 0.8 μl 的蛋白质样品与 0.8 μl 的基质混合，并立即点样到靶上。
( 3 ) 让样品在靶上干燥和结晶。
( 4 ) 用超纯水冲洗靶后，让其干燥。
当谱图稳定后，读取谱图（200~300 次激光轰击，见注释 8)。
3.6 数据库检索
现在有许多不同的搜索引擎可以用来鉴定已获得肽质量的蛋白质，ProFound [10] 能够很好地用来进行蛋白质混合样品（最多可达 4 种蛋白质）的鉴定。在我们的分析中，总是假设为混合样品（虽然也会出现最终的鉴定结果表示只有一种蛋白质)。检索所用的参数如下：合适的物种分类范畴（拟南芥或酿酒酵母）；质量误差为 0.1 Da ( 允许肽段质量偏离校准范围的最大值 )；允许 1 个酶切缺失位点；蛋白质分子质量范围：0~1000 kDa；pI 范围：0~14；氨基酸未被化学修饰。考虑到混合物中可能存在的蛋白质种类的数量，可以进行最多 4 次改变可能的蛋白质的数量设置（最大设置为 4)。存取检索运行中获得的最高分值的结果。对于每个鉴定的蛋白质，实验匹配质量用在最终的 ProFound “ 单个蛋白质” 检索。最后，那些可能性接近 1，且 Z 分值高于 1.65 的蛋白质才予以考虑。
