实验概要
本实验介绍了免疫共沉淀所需试剂配制及操作步骤。
主要试剂
1. RIPA Buffer配制
基础成分：
Tris-HCl(缓冲液成分，防止蛋白变性)
NaCl(盐份，防止非特异蛋白聚集)
NP-40(非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液)
去氧胆酸钠(离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存)
注意：准备激酶(致活酶)实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂
苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存)
EDTA(钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH7.4)
亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存)
抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存)
胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存)
RIPA磷酸(酯)酶抑制剂
激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液)
NaF(200mM的储存液，室温保存)
注意：在准备做磷酸(酯)酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂
2. 工作液配制
配制100ml的modified RIPA buffer：
1) 称取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4
2) 加10 ml 10%的NP-40
3) 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清
4) 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
5) 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF，Na3VO4，NaF各500 µl)，但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度：
a. Tris-HCl：50 mM，pH 7.4
b. NP-40：1%
c. 去氧胆酸钠：0.25%
d. NaCl：150 mM
e. EDTA：1 mM
f. PMSF：1 mM
g. 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂：各1 µg/ml
h. Na3VO4：1 mM
i. NaF：1 mM