免疫共沉淀试剂配制及技术路线

2020年9月21日 22:21:33 来源: 互联网
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实验概要

本实验介绍了免疫共沉淀所需试剂配制及操作步骤。

主要试剂

1. RIPA Buffer配制
基础成分:
Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)
NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)
NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)
去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)
注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂
苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)
EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH7.4)
亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)
抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)
胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)
RIPA磷酸(酯)酶抑制剂
激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液)
NaF(200mM的储存液,室温保存)
注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂
2. 工作液配制
配制100ml的modified RIPA buffer:
   1) 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4
   2) 加10 ml 10%的NP-40
   3) 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清
   4) 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存
   5) 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF,Na3VO4,NaF各500 µl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度: 
      a. Tris-HCl:50 mM,pH 7.4
      b. NP-40:1%
      c. 去氧胆酸钠:0.25%
      d. NaCl:150 mM
      e. EDTA:1 mM
      f. PMSF:1 mM
      g. 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂:各1 µg/ml
      h. Na3VO4:1 mM
      i. NaF:1 mM

实验步骤

准备工作:
1. 预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机;
2. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;
3. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶);
4. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上);
5. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中;
6. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠;
7. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景;
8. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子;
9. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月);
10. 用PBS将总蛋白稀释到约1μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl);
11. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异;
12. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育;
13. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG);
14. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS;
15. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道);
16. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。
通过免疫共沉淀确定结合蛋白:
1. 用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中;
2. 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min;
3. 收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h;
4. 加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min;
5. 用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次;
6. 吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min;
7. 将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜;
8. 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带;
9. 从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min;
10.用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱;
11.通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。


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