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抗生素检测方法的研究概况

2022.7.27

  摘要: 综述了近年来检测微量抗生素的几种常见方法,其中包括高效液相色谱法,超高效液相色谱 - 串联质谱法,酶联免疫法,微生物检测法,分光光度法和电化学分析法。阐述了各种方法的优缺点,并对今后抗生素检测的便捷方法进行了展望,希望建立一种高效简便的方法检测残留抗生素,以达到保障食品、药品安全,保护绿色生态环境,开发新技术和新型传感器的目的。

  关键词: 抗生素; 检测方法; 概况

  自 1929 年英国细菌学家 A.Fleming发现青霉素一类抗生素以来,抗生素便由于其对病原微生物的抑制或杀灭作用而广泛应用于预防和治疗感染性疾病。其在畜牧养殖业、临床医学、水产养殖等多个领域都极为常见,实用性也较强。我国对于抗生素的使用量以及生产量都位居世界前列。随着抗生素广泛的应用,一些弊端和威胁也开始出现。在临床中,抗生素可以用于治疗感染性疾病,但是抗生素的使用不当会造成人体的神经系统、肾脏、血液有不同程度的损伤,更有可能导致人体的死亡。在畜牧养殖业中,例如奶牛饲养,饲养者常常为了预防奶牛感染疾病,以获得优质的牛奶,便会在其饲料中添加抗生素; 为了避免奶制品的腐坏,也会在牛奶中加入抗生素,这些都会引起抗生素在牛奶中的残留,长期饮用含有抗生素的牛奶会对人体造成极大的损害。并且畜禽仅能吸收少量抗生素,多余的抗生素会随着粪便排泄到动物体外,会对环境,土壤等造成巨大的危害,对生态系统的损害是无法预计的; 抗生素的滥用情况始终威胁着人类的生存与发展,现在已成为一种新型环境污染物,其污染问题也逐渐引起人们的关注; 因此残留抗生素的检测成为化学领域的热点和难点。

  截止目前为止,抗生素的检测方法主要有高效液相色谱法,超高效液相色谱 - 串联质谱法,微生物检测法,酶联免疫法,分光光度法,电化学法等。

  1 抗生素常用检测方法

  1.1 高效液相色谱法

  高效液相色谱法又被称为高压液相色谱法,此法是将液体流动相和极性具有差异性的化合物质加入到高效液相色谱柱中,在柱内将样品的各组分分离,从而达到检测抗生素目的。

  潘晓东等采用乙腈作提取剂,探究了甲酸对流动相的影响。实验取三个不同浓度的样品放入色谱柱进行梯度洗脱和分离,根据色谱的保留时间来确定样品中是否含有被测抗生素,并对样品进行分析。由此检测出猪肉当中的 β - 内酰胺类抗生素的标准曲线具有良好的线性关系。王余磊等以乙腈和磷酸二氢钠溶液为流动相检测抗生素,在棕色瓶中用甲醇溶液将标准溶液 TC、OTC、CTC 分别定容到 10 mL,在样品经超声、离心、过滤等步骤后放入高效液相色谱中,检测结果表明样品鸡肉中的

  土霉素,金霉素和四环素均具有良好的线性关系,土霉素、金霉素和四环素的最低检出限分别为 20,100,20 μg·kg-1

  高效液相色谱法具有高速度、高效率、高灵敏度等优点。但是高效液相色谱法费用昂贵、操作复杂、重复性不好、检测限也偏高,在检测时也会出现假阳性等问题。

  1.2 超高液相色谱法

  超高效液相色谱 - 串联质谱法被广泛应用于各个领域以检测抗生素。李倩莹等采用电喷雾离子化,多反应检测模式和负离子扫描对抗生素进行检测。实验将5.0g 水产品试样进行离心、震荡、净化等步骤后制备标准曲线,实验表示其在 0.1~10 ng·mL-1范围内具有良好的线性相关系数,相关系数为 0.999 2。此法优化了浓缩和提取溶剂的用量方式,也优化了检测的色谱及质谱条件,从而达到预期检测效果。李宏亮等检测了尿中痕量的 14 种 β-内酰胺类抗生素,以色谱柱,乙酸铵的水-甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱,以酶消解提取、固相萃取净化、正离子扫描等多种检测模式对样品进行处理。结果检测其中12种β-内酰胺类抗生素均具有良好的线性范围。

  超高效液相色谱-串联质谱法对样品的流速要求极高。流速太快会导致回收率低; 流速太慢则会导致样品处理效率很差,会出现基质效应影响不明显等情况。

  1.3 酶联免疫法

  酶联免疫法是让抗体或者抗原和酶复合物结合,通过显色来检测被测物含量的方法。刘宏梅等人采用酶联免疫吸附法测定家禽配合饲料中氯霉素的含量,饲料经乙酸乙酯和正己烷处理后,取下层水样作为样品进行分析,在测定氯霉素标准曲线时,添加 TMB 作为显色底物; 以吸光度为纵坐标,不同浓度标准样品的氯霉素为横坐标,再根据吸光度值和氯霉素含量呈负相关的关系便可判断出其氯霉素的含量。该方法可以用于基层工作中的大规模筛选氯霉素的含量。区兑鹏等采用特异性强的间接酶联免疫法同时检测多种抗生素,建立水产品的多种药物残留量的快速检测分析方法。样品经 0.1mol /L 盐酸处理,60 ℃孵育 2 h,再由乙酸乙酯提取,使用酶联免疫试剂盒检测其抗生素含量。通过显色,可以直观的进行定性判断; 通过酶标仪,可以对六种物质进行定量分析。而且它的灵敏度和准确地满足日常的大量水产品的初步批量检测,缩短了检测时间,简化实验过程,提高了效率。

  酶联免疫法灵敏度高、特异性强、重复性好,但是它的操作步骤较多,要求操作者操作熟练。

  1.4 微生物检测法

  微生物检测法主要是通过观察微生物的生命活动来对抗生素进行检测,主要是根据被测样品中产生的抑菌圈的大小来判断样品中抗生素的残留状况。是一种定性或定量分析的方法。高晓月等用微生物显色法,以大肠埃希氏菌为指示菌,

  柠檬酸-丙酮为缓冲溶液,使其蛋白沉淀,并且其上清液的状态为无色透明,便于观察。该方法可用于畜禽肉中喹诺酮类、氨基糖苷类抗生素残留的检测,其检测限低于我国的规定值,并且该方法的准确性较高,没有假阴性结果的存在。陆其聪等通过观察菌种的生长情况来判断试样中叶酸含量的多少,用 5mg/mL 的抗坏血酸将磷酸盐缓冲溶液的 pH 值调至 6.8,再将鼠李糖乳杆菌接种到培养皿中,培养一段时间后测定其吸光度,根据标准的吸光度值曲线可以计算出试样中叶酸的含量。

  微生物检测法可以直观、特异性地反映抗生素的抗菌活性,但培养基的质量、原材料的种类、仪器的洁净程度等都会对实验造成不小的影响。

  1.5 分光光度法

  分光光度法是一种利用吸收光谱对物质进行分析处理的方法。李振等测定头孢噻呋钠的含量采用的就是紫外分光光度法,首先准确称取头孢噻呋钠加入醋酸铵中进行溶解,然后测定其浓度,结果曲线呈现了良好的线性关系。刘荣森等在 100 ℃下,借助头孢曲松钠将 Fe( Ⅲ) 还原成 Fe( Ⅱ) ,使其与邻二氮菲进行反应。根据形成的橘红色配合物情况对头孢曲松钠含量进行测定,结果显示头孢曲松钠浓度在最大吸收波长处呈良好线性关系。刘荣森等在此方法的基础上又将头孢唑啉钠放入氢氧化钠溶液中将其降解为含巯基化合物,然后加入适当的 FeCl3 生成可溶性普鲁士蓝,通过对普鲁士蓝最大吸收波长处的吸光度测定,从而检测出抗生素含量。结果表明头孢唑啉的钠含量具有良好的线性范围。

  分光光度法仪器操作简单、费用低,但是此实验对样品条件、测量浓度要求极高,会耗费大量时间,并且测定的结果不准确。

  1.6 电化学分析法

  电化学分析法是根据电化学池内溶液的化学性质和被测物性质进行分析的一类分析方法。其基础是电化学反应,应用电化学原理和技术,使电解质溶液和电极外接电路构成电化学池而发生反应。主要方法有电导法、电位滴定法、电解分析法、伏安法和电位溶出法。匡云飞等为进一步探索出准确度高和抗干扰性能强地检测氯霉素的方法,采用三电极体系,利用石墨烯和碳纳米管复合修饰玻碳电极为工作电极,以铂丝电极为辅助电极,甘汞电极为参比电极检测氯霉素的含量。实验选用 0.2 mol/L PBS 缓冲溶液作为支持电解质溶液,调节 pH 值为6.6~8.0之内,观察其电化学响应。结果显示该电极的检出限为 0.05 μmol/L,可用于药物中氯霉素的快速检测。许贺等以电解石墨棒的方式来制备石墨烯量子点,将 Nafion 和石墨烯量子点复合修饰到玻碳电极上,以 TE 缓冲溶液为电解质溶液,扫速为 50 mV/s 对氯霉素进行电化学检测。通过阳极溶出伏安法和示差脉冲伏安法来检测氯霉素,检出限为 1.67×10-7mol/L。陈宏等以金属有机材料镍-均苯三酸和聚丙烯酸钠混合修饰玻碳电极,采用循环伏安法对其进行检测,其检出限低于我国动物源性食品中残留量的标准。

  电化学检测准确度高、选择性强,抗干扰性能好,能迅速地检测微量氯霉素的含量。

  2 结语与展望

  随着抗生素广泛应用于临床医学,畜牧养殖业等领域,其残留情况也日益加剧,抗生素的残留会对环境、土壤和人体等造成不小的危害。所以对于食品药品、环境土壤方面抗生素残留情况的实时检测在食品保障、绿色生态环境保护方面都有重要意义。

  以高效液相色谱法来检测,其检测速度和灵敏度都有一定的优势,但是其检测费用过于昂贵、操作复杂、检测限高。以微生物检测法和超高液相色谱法对抗生素的残留状况进行检测,能够直观便捷地看到实验结果,但是其限制条件过于多,操作过于复杂,实验效果并不理想。像分光光度法,其仪器操作简单,费用低,但是对仪器要求很高,并且准确性不高。电化学分析法操作简单方便,灵敏度度高,选择性强,抗干扰性能好,检测限低,其准确性也优于其他方法。上述几种方法对于抗生素的检测都具有一定效果,但是也有一定的局限性。因此建立一种高效简便的电化学方法来检测微量残留抗生素是我们研究的重点与方向。对于我们现实生活中抗生素的检测、新技术和新型传感器的开发等都具有重要意义。

文章来源:杨耀彬,刘爽,冯佳莹,石小棉.抗生素检测方法的研究概况[J].山东化工,2022,(12):106-107+114.

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