T 细胞中丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK) 活性分析

2019.4.06

实验步骤	基本方案 1 免疫复合物蛋白激酶测定此方法可用于测定 E R K 、 J N K 和 p38 M A P K 的活性，也可使用针对每个 M A P K 组分的商品化抗体。然而，特定的抗体对各组分内特定的亚型会显示一定的特异性。材料基本方案 2 固相蛋白激酶法检测 J N K 活性这种方法最适合于测定 J N K 活性，它依赖于 J N K 与它的靶转录因子 c-J u n 的 N H 2 末端活化区结合的特异性。材料清晰。在真空中 80°C 下利用干胶仪在 Whatman 3M M 滤纸上将其干燥 lh。 9 . 确认在每一步试验中底物蛋白质的水平均相同。将凝胶曝光在 X 射线胶片上使其显影或者利用磷成像仪分析法，对 32P 掺入 GST-cJun (1-79) 的量进行定量。基本方案 3 SDS-P A G E 后原位检测 J N K 蛋白激酶活性 [「胶内」（IN-G E L ) 激酶测定] 该方案改良自 Gotoh 等 1 9 9 0 年报道的方法。由于 J N K 对 GST-cJmi ( 1 - 7 9 ) 具有高特异性，所以该方案最适合测定 J N K 活性。如果在胶中加入 GST-Elkl (310-428) 或 M B P ，该方案也适用于检测 E R K 的活性，但此时也能检测出其他能催化 Elkl 或 M B P 的激酶，在分析结果时应特别注意。材料基本方案 4 利用磷酸化位点特异性抗体检测 M A P K 的活化用 Biosource、 Cell Signaling Technology 及 Promega 公司的抗体均可进行如下所述的检测，本方案将以 Cell Signaling Technology 的磷酸化-S A P K / J N K (Thr-183/Tyr- 1 8 5 ) 抗体为例。这一方法检测的是 M A P K 的活化作用，因此并非直接测定 M A P K 的活性。材料辅助方案制备 GST-M A P K 底物融合蛋白 GST-Elkl (310-428) 用作 E R K 的底物、 GST-cJim (1-79) 用作 J N K 的底物、 G S T -A T F 2 (1-109) 用作 p38 的底物。材料感受态的 (B L 21; Novagen) 编码 G ST -M A P K 底物融合蛋白的质粒 DNA (来自 Roger.Davis@ Umassmed.edu 或 Alan.J.Whitmarsh @ man.ac.uk，或类似质粒），或纯化的 cjun 和 ATF 展

实验步骤

基本方案 1 免疫复合物蛋白激酶测定

此方法可用于测定 E R K 、 J N K 和 p38 M A P K 的活性，也可使用针对每个 M A P K
组分的商品化抗体。然而，特定的抗体对各组分内特定的亚型会显示一定的特异性。

材料

基本方案 2 固相蛋白激酶法检测 J N K 活性

这种方法最适合于测定 J N K 活性，它依赖于 J N K 与它的靶转录因子 c-J u n 的 N H 2 末端活化区结合的特异性。

材料

清晰。在真空中 80°C 下利用干胶仪在 Whatman 3M M 滤纸上将其干燥 lh。
9 . 确认在每一步试验中底物蛋白质的水平均相同。将凝胶曝光在 X 射线胶片上使其显
影或者利用磷成像仪分析法，对 32P 掺入 GST-cJun (1-79) 的量进行定量。

基本方案 3 SDS-P A G E 后原位检测 J N K 蛋白激酶活性 [「胶内」（IN-G E L )

激酶测定]
该方案改良自 Gotoh 等 1 9 9 0 年报道的方法。由于 J N K 对 GST-cJmi ( 1 - 7 9 ) 具有
高特异性，所以该方案最适合测定 J N K 活性。如果在胶中加入 GST-Elkl (310-428)
或 M B P ，该方案也适用于检测 E R K 的活性，但此时也能检测出其他能催化 Elkl 或
M B P 的激酶，在分析结果时应特别注意。

材料

基本方案 4 利用磷酸化位点特异性抗体检测 M A P K 的活化

用 Biosource、 Cell Signaling Technology 及 Promega 公司的抗体均可进行如下所述
的检测，本方案将以 Cell Signaling Technology 的磷酸化-S A P K / J N K (Thr-183/Tyr-
1 8 5 ) 抗体为例。这一方法检测的是 M A P K 的活化作用，因此并非直接测定 M A P K 的
活性。