一、ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性 1. 取6~8 周龄C57BL16小鼠,拉颈处死,无菌取胸腺置不锈钢网筛上,用注射器针蕊研磨成细胞悬液调整细胞数为1.5×107 /ml
2. 细胞悬液内加入ConA,使终浓度为3 μg/ml,在96孔培养板中加100 μl(1.5×106细胞) 3. 加入不同稀释度待测样品和IL-1标准品100 μl/孔(ConA终浓度为1.5 μg/ml),37 ℃ CO2孵箱 66 h 4. 每孔加3H-TdR 0.5 μci,37 ℃ CO2孵箱 6 h 5. 多头细胞收集仪收获于9999型玻璃纤维纸上 6. 烤干,移入液闪瓶中,加适量闪烁液,于液闪仪上测β计数
7. 计算
(1)从IL-1标准曲线上测得IL-1的活性单位 (2)也可用刺激指数(SI)表示 实验组cpm SI=────── ×100% 对照组cpm
二、应用EL-4 CTLL检测IL-1生物学活性 1. 用EL4细胞两步法检测IL-1活性 (1)收集处于对数生长期的EL4细胞 (2)洗涤后,用1 %FCS RPMI1640重悬细胞,并调整细胞浓度2×106 /ml (3)加处96孔板中,100 μl/孔 (4)加入不同稀释度的IL-1α或IL-1β,100 μl/孔,同时设1 %FCS RPMI 1640对照 (5)5 %CO2 37 ℃培养18~24 小时 (6)按终稀释度为1∶10~20转入另一块96孔板中 (7)用CTLL-2 检测IL-2活性、检测方法见"IL-2检测" 2. 用EL4细胞一步法检测IL-1活性
(1)用5 %FCS RPMI 1640调整EL4细胞浓度至2×105 /ml,CTTL-2浓度至4×105 /ml (2)加入96孔板中,两种细胞各加50 μl/孔 (3)加入不同稀释度的IL-1或待测样品,同时设EL4和CTLL-2细胞对照 (4)置5 %CO2,37 ℃培养24~28 小时后加入3H-TdR,0.5 μci/50 μl/孔,继续培养6~8 小时 (5)收集样品,β计数 展开 |