PCR技术应用二： 骨肿瘤诊断
骨肿瘤较罕见，恶性骨肿瘤只占全身恶性肿瘤的1%，男多于女，性别比约为1.6 ∶1，均好发于10-30岁间，良性者以骨软骨瘤最多，依次为骨巨细胞瘤、内生软骨瘤 等，恶性者以骨肉瘤最多，依次为软骨肉瘤、纤维肉瘤等.骨恶性肿瘤的发生机理目 前认为是癌基因显性作用与抗癌基因失活的结果，是多种癌基因多阶段多途径协同作 用的结果.骨恶性肿瘤转移涉及到肿瘤细胞自身与宿主细胞之间错综复杂的关系，受 多种相关基因的调控，即肿瘤的转移与转移基因和转移抑制基因有关，与生长因子及 其受体的表达以及某些癌基因产物有关.因此，通过对活化的癌基因及抗癌基因改变 的检测，可以快速分析患者肿瘤的易感性及判断肿瘤的预后;检测耐药基因的表达程 度，可为肿瘤的诊治提供方案选择的依据;通过对转移基因及转移抑制基因的检测， 可以判断肿瘤有无转移，对手术治疗案提供依据.
PCR技术是一门新型快速诊断技术，具有敏感、特异、专一性强等特点，在骨肿 瘤诊断及研究方面具有其它方法难以比拟的优越性.
一、PCR技术在骨肿瘤诊断中的应用
骨肿瘤诊断需要解剖学、组织学和胚胎学等基础知识，对病变需认真观察，仔细 分析，但更重要的是对临床资料及X线所见要特别重视.骨肿瘤形态变异较大，而临床 X线观察较全面，病理镜检有一定局限性，而一些癌基因改变是与某一型骨肿瘤密切 相关，即为肿瘤特异性基因，因此在骨肿瘤诊断方面在坚持临床、X线及病理三结合 的诊断原则基础上，通过PCR技术对肿瘤特异性癌基因变化的检测，可以更好地辅助 骨肿瘤的诊断，具有其它方法不可代替的优越性.
1.成骨系统肿瘤的诊断
本系统中恶性肿瘤最多见的是骨肉瘤，由于骨肉瘤类型繁多，有多方向分化特 点，故形态复杂，除常见的成骨型、成软骨型、成纤维型外，尚有较罕见的恶纤维 型、血管扩张型、小圆细胞型，髓内高分化型和富于巨细型的骨肉瘤.骨肉瘤虽多由 髓内发生，但也可由骨外膜发生，向外生长形成骨表面骨肉瘤.骨表面骨肉瘤近年来 又根据其形态及恶性度的不同分成四个亚型，尽管各型有其形态特征，但在常规诊断 时还是有不少被误诊.肿瘤生物学研究表明，骨肉瘤中细胞DNA含量明显高于正常细 胞，并具有一系列癌基因的改变，如骨肉瘤中75%的P53基因突变，mdm2、c-myc及 c-raf扩增，TPR-met重排等.
首先，我们可以用定量PCR方法检测细胞中DNA含量，来判断肿瘤的良恶性，接 着，利用多重PCR或巢式PCR检测P53、mdm2、c-raf、met等的基因改变，来确诊是否 为骨肉瘤，同样可以利用数种骨肉瘤特异的单克隆抗体，采用免疫PCR方法对骨肉瘤 进行诊断及分型.随着nm生物学技术的发展，可以利用原位PCR方法，先确定好特异性 癌基因产物的位置，然后在透射电镱下动态观察其形态及结构，这样可以更好地确诊.
2.软骨系统肿瘤的诊断
软骨肿瘤的恶性程度除与细胞异形性有关外，和肿瘤发生部位及其体积大小亦密 切相关.发生在近心端的如骨盆、肩胛等直径大于6cm者，即使细胞异形性不太明显， 也可能为高分化软骨肉瘤，反之若肿瘤发生在远端，虽细胞较密集有中等程度异形 性，但一般显示良性生物学行为，可诊断为良性肿瘤.软骨肿瘤分类也十分复杂，根 据形态学诊断易误诊，从基因水平来诊断更符合实际情况.首先要区分是良性肿瘤还 是恶性肿瘤，运用定量PCR方法，检测细胞中DNA含量，可以判断良恶性.其次，要与 骨及其它组织肿瘤相鉴别.研究表明，Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、骨形成蛋白、骨钙素、 骨连接蛋白等均为骨特异性蛋白，运用定量PCR方法，检测相应基因的表达程度可以 确定其组织来源，同样也可以利用相应的单克隆抗体，采用免疫PCR方法确定其组织 来源及分型.
3.骨恶性肿瘤转移的诊断
近几年的研究表明，癌基因mdm2的扩增与骨恶性肿瘤的转移密切相关，mn23-H1 在转移的骨恶性肿瘤中呈低表达，在分化良好的肿瘤中呈高表达.因此，运用定量PCR 方法检测癌基因mdm2扩增程度，以及mn23-H1的表达程度可以判断骨恶性肿瘤有无转 移.
4.骨恶性肿瘤治疗效果的判断
近几年的研究表明，微小转移灶在骨恶性肿瘤发生后不久就存在于周围的血液循 环中，骨肿瘤的手术治疗只能解决局部问题，而微小转移灶的清除必须依赖于放疗、 化疗或免疫治疗，因此，检测外周血中有无微小残余病灶，可以判断治疗效果，并对 是否需要继续治疗提供依据.
二、PCR技术在骨肿瘤研究中的应用
1.在骨肿瘤发病机理研究中的应用
骨恶性肿瘤是多种癌基因多阶段多途径协同作用的结果，到目前为止，发现与骨 恶性肿瘤密切相关的癌基因有K-ras、c-fos、proα-1、proα-2、c-sis、c-raf、 c-myc、met、mdm2，抗癌基因有Rb、P53、P16等.发现的癌基因已有100多个，抗癌基 因有8个，它们当中究竟还有哪些与骨恶性肿瘤发生发展有关，仍有待于进一步研究. PCR技术是一门快速诊断技术，尤其是PCR相关技术的发展，给分子水平的研究带来了 一场革命.使研究的效率大大提高.
①骨恶性肿瘤中癌基因突变、缺失、重排的研究癌基因突变重排常导致肿瘤的发 生，因此检测癌基因的改变对研究骨肿瘤发生机理具有重要意义.传统的方法是提取 DNA，走电泳，转移到NC膜上，再用标记的探针进行杂交，检测缺失、重排、突变.方 法比较繁琐，放射性同位素对人体亦有害，而PCR技术利用一对引物就可以把待检的 DNA片段扩增出来，再利用RFLP技术或SSCP技术就可以检测出有无重排、缺失、突 变，既方便快速，又对人体没有任何伤害.
②骨恶性肿瘤中癌基因扩增与表达的研究 特异性癌基因的扩增与高表达常导致骨肿瘤的发生，找出这种特异性癌基因对骨 恶性肿瘤的发病机理的研究具有重大理论意义，同时，也给临床诊断骨肿瘤带来特异 性指标.传统的研究方法首先要提取DNA或RNA进行紫外定量，并用尿素变性电泳鉴定 有无降解，然后再转移或打点至NC膜上，用相应的标记好的探针进行杂交，放射自显 影，最后进行灰度扫描来定量，这种研究方法最快也得需要二周时间，而定量PCR技 术则只需50-80ng的模板DNA或RNA，扩增25个循环，就可以从计算机中打印出结果， 得出原始模板当中某个癌基因的拷贝数，可以直接判断出有无某种癌基因的扩增与高 表达.运用PCR方法筛选这种特异性癌基因，方法简便，快速，在较短的时间内可以完 成相当大的工作量.
③骨恶性肿瘤特异性抗原基因的筛选研究 十多年来对骨恶性肿瘤细胞株的研究表明，骨恶性肿瘤中存在一些特异性抗原与 相关性抗原，并且已经研制成了一些特异性单克隆抗体，但是到目前为止，尚未有人 筛选出骨恶性肿瘤特异性抗原的基因，传统的研究方法是首先从大量肿瘤组织中提取 肿瘤抗原，然后免疫动物，取脾脏等与杂交瘤融合，再从阳性克隆中筛选特异性的单 克隆抗体.这种单抗，运用于人体仍然可引起免疫反应，故在九十年代开始，已进行 人源性单抗的研制，尤其是丝状噬菌体呈现技术的运用，使得人源性全套抗体库的构 建获得成功，避免了免疫动物等一系列繁琐途径.全套抗体库的构建首先利用mRNA.直 接反转录成cDNA，构建成cDNA文库，根据抗体可变区基因两侧序列的保守性，设计与 之结合的一对引物，以cDNA为模板，PCR扩增出抗体可变区重链和轻链基因，用接头 DNA连接起来，再与丝状噬菌体基因Ⅲ5'端重组，表达于噬菌体表面，然后将噬菌体 抗体文库通过表面结合有特异性肿瘤抗原的亲和柱，就可以筛选出相应的人源性单克 隆抗体.然后对单抗进行部分氨基酸序列分析，反推出数个寡核苷酸，以这几个寡核 苷酸为引物，运用AP-PCR方法直接筛选出相应的抗原基因.
2.在骨肿瘤转移机理研究中的应用
①nm23-H1基因与骨恶性肿瘤转移相关性研究 nm23-H1基因是转移抑制基因，它已在多种肿瘤中发现与转移有关，但在骨肿瘤 中结果如何未见报道，作者拟对18例骨恶性肿瘤标本运用定量PCR仪，检测了nm23-H1 表达程度.
引物P1为:5'GGGACGCAACTGTGAGCGTACCTTC3'；
引物P2为:5'GATTGGATCCTCATTCATAGATCCAGTTCTGACC3'
利用带有荧光信号的通用接头把荧光信号标记在P15'端，运用定量PCR仪，以正 常肝脏组织总RNA为模板，进行一系列倍比稀释，运用RT-PCR一步法直接扩增.结果表 明，当模板为80ng时，25个循环后，扩增产物量与扩增指数呈线性关系，因此，当模 板采用80ng时，利用定量PCR仪可检测出原始模板中nm23-H1拷贝数，从而可以判断出 nm23-H1的表达程度.(研究表明，nm23-H1与骨恶性肿瘤转移有关)同理，可以运用定 量PCR仪进行多种癌基因的检测，从而筛选出与转移相关的癌基因.
②骨肿瘤转移基因的筛选研究 基因直选法是建立在分子杂交和PCR技术基础上的一项基因分离技术，可以运用 于骨肿瘤转移相关基因的筛选.基本原理是利用人的基因组区做诱饵，从骨肿瘤cDNA 文库中钓出其互补区，然后进行PCR反应，使钓出的CDNA大量扩增，再将CDNA克隆进 行直接测序分析，然后用定量PCR方法检测临床转移与非转移标本，看表达相差的程 度，来进一步证实是否为骨肿瘤转移相关基因.这种方法特别适用于正常情况下表达 很低的转录单位相应基因的分离.总之，PCR技术是一门非常有用的技术，掌握它可以 给基础研究及临床诊断带来难以想象的收获，尤其是PCR相关技术的发展给基础研究 带来了一场新的革命，PCR技术必将会获得越来越广泛的应用.
