干货丨新冠病毒Nanopore测序标准操作流程
2019新型冠状病毒Nanopore测序标准操作流程-PCR扩增测序版简介
新近在武汉出现的新型冠状病毒引发的肺炎疫情引起了社会各界的极大关注。对新型冠状病毒进行测序不仅能够为病原鉴定、病毒溯源与变异、传播力和传播机理等研究提供切实可靠的基因组信息，还能够为识别病毒传播方式和确定暴发范围提供重要的线索，为及时完善防控策略和措施奠定完善的理论基础。
MinION测序仪由于其长读长、可移植性强、可实时访问测序数据且具有非常低的初始成本，因此在许多临床情况下越来越多地用于对各种病毒病原体进行测序。尤其在新冠肺炎诊疗方案（试行第五版）中，病例确诊采用“逆转录酶聚合酶链反应 （RT-PCR）”核酸检测与基因测序两种方式，可见在新冠肺炎核酸与抗体检测等方法还不完善时，临床急需MinION这样的小规格设备对新型冠状病毒进行实验室或现场快速检测。虽然Oxford Nanopore 的技术专家们正在积极与纳米孔社区的科学家通力合作，支持开发对新型冠状病毒测序的最佳实践和实验方案，但是，缺乏关于新型冠状病毒基因组的MinION测序的详细步骤。
ARTIC Network是一个旨在为病毒爆发开发方案，提供实时的流行病学信息以供公共卫生机构判断并采取行动的项目。由包括牛津大学、剑桥大学和爱丁堡大学在内的多所大学联合组成。ARTIC network 发布了一套可协助研究人员测序新型冠状病毒2019-nCov的实验材料，包含引物设计、实验方案、生信学教程和数据库 （https://artic.network/ncov-2019 ）。
在整理ARTIC network发布的测序流程基础上，还整合了北京市卫健委、北京协和医院-2019新型冠状病毒核酸检测标准操作流程。希望这个详尽的中文流程能够为新型冠状病毒的各项攻关任务提供参考，并对抗击疫情的第一线提供切实有效的帮助，使更多研究者能够更快速地把研究成果应用到战胜疫情中。
本流程使用的试剂盒、耗材参考如下：
目 录
一 核酸提取标准操作流程
（一）新冠核酸检测前准备
操作区域：应在基因扩增实验室洁净区或普通实验室的清洁区。
1. 戴一次性帽子
2. 戴医用N95口罩, 检查口罩密闭性
3. 穿一次性防护服
4. 穿一次性鞋套
5. 穿一次性防水靴套
6. 戴第一层乳胶手套,检查手套密闭性
7. 检查隔离衣的舒适性, 通过下蹲等动作，已达到核酸检测和防护要求
8. 穿外层一次性隔离衣, 有条件时加穿、由他人协助完成
9. 戴防护目镜
10. 戴第二层乳胶手套, 检查手套密闭性
注: 穿戴完毕后，尽快穿过专用缓冲间或走廊进入核酸提取区或专用的核酸提取实验室。
（二）样本的灭活处理
操作环境：核酸提取和加样实验室
注：需由2名工作人员进入核酸提取和加样实验室。生物安全柜内应配备吸水棉及消毒酒精（有条件可配吸水台布，已备样本溢撒处理）
1. 打开二级容器，用75%酒精消毒样本密封袋外表面并检查样本管密闭性
2. 灭活条件：56℃，30分钟(可用水浴等多种方式)
3. 取出灭活样本管，酒精擦拭外表
4. 样本放入到生物安全柜内
（三）手工核酸提取(或者四、用仪器提取核酸)
操作环境：第一步环境为试剂配制区或另一件单独的洁净区，第二、三步环境为核酸提取和加样实验室。
注：本过程使用QIAGEN Viral RNA Mini Kit进行，操作环境为进入试剂配制区或另一件单独的洁净区
1、试剂配制区准备：AW1、AW2、Carrier RNA
1.1 在AW1中加入无水乙醇130mI
1.2 在AW2中加入无水乙醇160mI
1.3 在310ug Carrier RNA中加入310ul AVE，颠倒混匀使其充分溶解
1.4 完成AW1、AW2、Carrier RNA配制
后通过传递窗传递到样本处理区或由专人送到核酸提取实验室
2、样本的裂解
2.1取消毒无菌的1.5mL EP管
2.2取560ul AVL裂解液
2.3加入5.6ul Carrier RNA，在AVL裂解液中加入
2.4加入140ul 待测样本，已灭活待提取样本
2.5涡旋振荡15秒
2.6室温静置10分钟，裂解样品
2.7将EP 管放入离心机内瞬时离心，去处可能残留在EP 管盖上的裂解产物，防止污染
2.8加入560ul 无水乙醇
2.9涡旋振荡15秒
2.10将EP 管放入离心机内瞬时离心，去处可能残留在EP 管盖上的裂解产物，防止污染
3、提取核酸
3.1向离心柱加入裂解产物630ul
3.2 8000转离心1分钟，若离心机等设备在生物安全柜之外，离心管每次进出需对离心管外表面消毒
3.3更新废液收集管，小心取出离心柱，将上层离心柱转移到新收集管中
3.4将剩余约630ul 裂解产物加入离心柱，若样本体积提取大于140ul 时，重复此步骤直至所有产物离心
3.5 8000转离心1分钟，小心将离心柱转移到新收集管中
3.6取500ul AW1加入离心柱中，请将吸头接触离心柱内壁缓慢加样，8000转离心1分钟，小心将离心柱转移到新收集管中
3.7取500ul AW1加入离心柱中，8000转离心1分钟，小心取出离心柱，更换新收集管
3.8取500ul AW2加入离心柱中，14000转离心3分钟小心取出离心柱，更换新收集管
3.9离心机最大转速，离心1分钟，确保将AW2残液离心干净
3.10取无菌1.5mL EP管收集核酸，将离心柱小心放入1.5mL EP管中
3.11取40-60ul AVE加入离心柱上，AVE 洗脱液尽量全部覆盖离心柱膜，用EP 管盖盖住离心柱
3.12用无菌剪刀剪去原离心柱管盖，室温静置1分钟
3.13 8000转离心1分钟，回收核酸，丢弃离心柱，获得提取核酸，做好标记
（四）用仪器提取核酸(或者三、手工核酸提取）
1.准备提取试剂，按相关说明书
2.加入200ul 灭活样本
3.上机提取核酸
4.提取完成，回收核酸
（五）PCR体系的配制
1、配制PCR反应体系
注：进入试剂配制区或另一件单独的洁净区，以某牌试剂为例（总25ul 体系），按说明书配制
1.1根据检测数量配制体系
1.2充分混匀及离心
通过传递窗传递到样本处理区或由专人送到核酸提取实验室
2、加入核酸和对照
操作环境为：核酸提取和加样实验室
2.1每孔分装20ul 反应体系
2.2各孔分别加入5ul 待测样本核酸或阴阳性对照，每次检测需包含1个阳性对照和3个阴性对照，且阴性对照随机分布
2.3密封PCR管，有条件时模板加样在单独生物安全柜内
将配好的PCR管通过传递窗送入扩增区或由专人单独送入单独的PCR扩增区
（六）上机检测及结果分析
操作环境：进入PCR扩增区或另一件单独的扩增专用实验室
1.从传递窗取出PCR反应管
2.上机前混匀、离心反应体系
3.按试剂盒说明书设置扩增参数并分析判读结果
注：结果分析时，认真阅读试剂盒说明书，了解试剂盒灵敏度等性能指标和方法学局限性基础上，结合本次实验结果阴阳质控状况，综合判读结果
4.反应后PCR管应装入密封袋后立即放入制定垃圾桶，为防止扩增污染、反应后PCR管严禁开盖
（七）检测后的消毒处理
1.样本处理完成后：
用75%酒精消毒处理外层手套并脱下外层手套放入生物安全柜内垃圾桶中
2.检测完成后
2.1 0.5%-1%有效氯消毒液或75%乙醇擦拭工作台面及地面
2.2将安全柜内产生的医疗垃圾用三层垃圾袋密封
2.3将新冠检测医用垃圾放入指定垃圾桶
2.4垃圾袋上标记医疗垃圾信息
3.实验结束后：
3.1生物安全柜和实验室空间，紫外照射消毒，时间至少30分钟
3.2工作人员：0.5%-1%有效氯消毒液或75%乙醇，均匀喷雾消毒一次性隔离衣，他人协助；脱去一次性隔离衣，放入新冠检测医用垃圾指定垃圾桶
注：工作人员离开二级实验室后，在缓冲区或走廊按顺序摘脱个人三级防护用品
4. 摘脱个人三级防护用品
4.1戴新外层手套
4.2摘护目镜，并置于75%乙醇中消毒浸泡
4.3脱一次性防护服
4.4脱外层手套
4.5摘N95一次性口罩
4.6摘一次性帽子
4.7脱一次性鞋套
4.8脱手套
注：防护服及医疗垃圾均需进行高压处理
5. 垃圾处理
5.1高压前后医疗垃圾严格区分
5.2 121℃，30分钟 湿热高压处理
5.3取出湿热后垃圾，高压试纸变色为有效
5.4已高压后医疗垃圾作为普通医疗垃圾处理
二 测序样品准备
注：本流程使用到的试剂盒为Nanopore LSK109，即连接测序试剂盒（Ligation Sequencing Kit），提供灵活的方法，可使用dsDNA样本（比如，gDNA，cDNA或扩增子）来构建测序文库。
构建文库方法：通过使用NEB Next末端修复/加dA尾模块试剂盒（NEB Next End Repair/dA-tailing module）来进行DNA末端修复和dA尾添加，然后把试剂盒中提供的测序接头连接到制备好的DNA末端。
获取病毒RNA样品后，主要过程为逆转录，PCR扩增引物见https://github.com/artic-network/artic-ncov2019/tree/master/primer_schemes/nCoV-2019/V1，为不同样品添加“Barcode”，加接头序列，然后建库上机。
1 逆转录
注：此步骤主要目的为将病毒RNA样品逆转录成DNA，来源人临床样本的病毒RNA，作为测序样品，其Ct值应在18-35；若其Ct值在12-15，则应使用水将样品稀释100倍；若其Ct值在15-18，则应使用水将样品稀释10倍。
1.1 取从样品中提取出来的RNA样品，配制混合体系于0.2ml 8连排PCR管中：
1.2 使用移液枪轻轻混合液体，然后，使用掌上离心机短暂离心。
1.3 按以下条件，孵育反应体系：
1.4 将以下反应物添加到退火的模板RNA中：
1.5使用移液枪轻轻混合体系，后使用掌上离心机短暂离心。
1.6在以下条件，孵育反应体系：
2 PCR扩增
对未知序列的样品测序时，应用随机引物对DNA样品进行PCR扩增，即为随机引物PCR。
2.1 将提前设计好的冻干粉引物用Nuclease-free Water制成100uM；
2.2 通过取每对引物5µl添加到1.5ml标有“ Pool 1(100µM)”或“ Pool 2(100µM)”的Eppendorf EP管中来生成引物库，其总体积应为490 µl；
2.3 使用Nuclease-free Water以1:10的比例稀释该引物库，以生成10µM的引物储备液；为了防止意外的污染或者降解，建议将引物库进行等分稀释保藏；注意：每种引物在反应体系中的终浓度应为0.015µM。在这种情况下，两个引物库中都有98个引物，因此25µL反应体系需要3.6µL引物库(10uM)。对于其他方案，请适当调整添加的体积。
2.4 配制以下反应体系于200ul 8连排PCR管中：
Lot. M0493S, NEW ENGLAND
2.5 向每个试管中加入2.5 µl cDNA，使用移液枪将其充分混匀。
2.6 使用掌上离心机短暂离心。
2.7 按如下条件设置：
注：使用PCR仪进行加热反应，若需要设置热盖温度，建议热盖温度高于反应的最高温度，防止冷凝水形成；PCR反应的循环数与样品RNA的Ct值相关，Ct值为18-21，循环数可设置为25；Ct值为35时，达到最多循环数35。
2.8 将每个样品对应的“Pool 1”和“ Pool 2”两个 PCR反应的反应体系合并到一个1.5 ml Eppendorf EP管中。
注：以上14步反应应在“RNA专用超净台或生物安全柜”中进行，操作前应使用酒精擦拭，并紫外照射杀菌。
3 产物纯化
按以下步骤纯化反应体系：(本纯化过程使用AMPure XP磁珠进行)，此步仍在上述提到的“RNA专用超净台或生物安全柜”中进行，避免样品RNA的降解和污染。
3.1提前半小时将磁珠室温孵育，使用涡旋震荡仪彻底震荡AMPure XP磁珠，确保其混合均匀，溶液应为均匀的棕色；
3.2将等体积（1:1）的AMPure XP磁珠添加到样品管中，并通过轻弹或移液轻轻混合。例如，将50 µl AMPure XP磁珠加入50 µl反应体系中；
3.3使用掌上离心机短暂离心；
3.4室温孵育5 min；
3.5将试管转移到磁力架上，静置2 min，至磁珠被吸引到磁力架一侧或混合液变澄清；
3.6小心弃上清液，注意不要接触磁珠；
3.7向沉淀中加入200 µl室温放置70％乙醇溶液；
3.8片刻后，小心地除去并丢弃乙醇，注意不要接触磁珠；
3.9跳到3.7，使用70％乙醇二次清洗除杂；
3.10用掌上离心机短暂离心，用移液器小心弃去残留的液体，避免接触磁珠；
3.11打开试管盖，静置1min，或直到沉淀磁珠表面失去光泽(如果沉淀完全干燥，它将破裂并变得难以重悬)；
3.12将沉淀的磁珠重悬于30 µl洗脱缓冲液(EB)中，用手指轻弹或使用移液枪轻轻混合，后放在磁力架上孵育2min，至磁珠被吸引到磁力架一侧或混合液变澄清；
3.13将上清液转移到干净的1.5mL EP管中，确保没有磁珠转移到该管中；
3.14取1 µl 样品使用Quantus™ Fluorometer或Qubit™进行荧光定量。
4 对扩增产物进行荧光定量
使用Quantus™ Fluorometer/ Qubit™对样品进行荧光定量：如果样品浓度大于25 ng/µL，则通过添加270 µL 10mM Tris将样品稀释10倍，并使用Quantus™/ Qubit™荧光计再次定量。
4.1从冰箱中取出Lambda DNA标准溶液(400 ng/µL)，放在冰上融化备用。从冰箱中取出ONE dsDNA Dye solution，室温融化备用；
4.2取两个用于校准的0.5 ml EP管，分别标记为“Blank”和“Standard”；
4.3 每个试管中加入200 µl ONE dsDNA Dye solution；
4.4使用移液枪混匀Lambda DNA标准溶液，并且加1 µl至“Standard”管中；
4.5使用涡旋震荡仪剧烈混合5 s，然后使用掌上离心机短暂离心；
4.6室温孵育2 min；
4.7选择“Calibrate”，选择“ONE DNA”，后将“Blank”样品放入仪器中，选择“Read Blank”。然后，将“Standard”放入阅读器，然后选择“Read Std”；
4.8准备好为所有样品进行荧光定量的0.5 ml EP管；
4.9在盖子上标记EP管，避免在EP管的侧面做标记，造成干扰样品读数；
4.10在每EP管中加入199 µl ONE dsDNA dye solution；
4.11加1 µl样品到对应的EP管中；
4.12使用vortexing（涡旋震荡仪）剧烈混合样品5s，用掌上离心机短暂离心；
4.13室温孵育2min；
4.14在Quantus™ Fluorometer的主屏幕上，选择“Protocol”，然后选择“ONE DNA”作为测定类型；
4.15在主屏幕上，将“样品量”设置为1 µl，“单位”为ng/µL；
4.16把第一个样品放入荧光计中，关闭盖子，样品浓度自动显示在屏幕上。按此操作检测其余样品；
4.17屏幕上显示的值是dsDNA浓度（以ng/µL为单位），将所有结果仔细记录在电子表格或实验室笔记本中。
5 不同的实验样品添加接头
注：为不同的实验样品添加接头（Barcode），即为不同的样品加上标签，如果你只有一个实验样品则可以省略此步。如果你有两个以上的样品，通过添加不同的标签，使不同样品间相互区分，则可以一起进行测序反应，节省了测序时间和成本。
5.1为每个样品准备好一个1.5m EP管；
5.2通过将每个样品稀释为1ng/ul来标准化样品浓度；
5.3为不同样品添加其对应的“二维码”即“native barcoding”。
5.3.1每个样品配制如下反应体系：
5.3.2 按如下条件孵育反应体系：
5.3.3将以下反应物直接添加到之前的反应体系中：
注: 在这里，每一个样品都可以使用EXP-NBD104（1-12）和EXP-NBD114 （13-24）中包含的所有Barcode，在“一个样品文库”中可以使用6-24个Barcodes，使Nanopore芯片达到最大的产能。
5.3.4按以下条件孵育反应体系：
5.3.5将上述所有反应体系转移到一个新的1.5 ml EP管中；
5.3.6上述样品进行荧光定量：步骤参考步骤4；
5.3.7按如下体系配制AMII接头蛋白连接体系：
5.3.8室温孵育15min；
5.3.9按照1:1的比例向样品管中加入AMPure XP磁珠，使用手指轻弹或用移液器轻轻混匀。注：提前半小时将磁珠室温孵育，使用前彻底涡旋AMPURE XP磁珠以确保将其充分重悬，溶液应为均匀的棕色；
5.3.10使用掌上离心机短暂离心；
5.3.11室温孵育5 min；
5.3.12将试管转移到磁力架上，静置2 min，至磁珠被吸引到磁力架一侧或混合液变澄清；
5.3.13小心弃上清，注意不要接触磁珠；
5.3.14加入200 µl SFB，并通过移液器混合将磁珠完全重悬；
注：SFB将去除多余的接头蛋白而不会接头蛋白-RNA复合物。请勿使用在早期清理中用到的70％乙醇。
5.3.15使用掌上离心机短暂离心；
5.3.16除去上清液并丢弃；
5.3.17重复步骤14-16进行SFB二次清洗；
5.3.18使用掌上离心机进行短暂离心以去除多余的SFB溶液；
5.3.19加入15 µl EB溶液，并使用移液枪重悬磁珠；
5.3.20室温孵育2 min；
5.3.21放置于磁力架上，静置2 min，待磁珠被吸引至靠近磁力架的一侧或溶液变澄清；
5.3.22转移最后的上清液到一个新的1.5 mL EP管，此样品即为建库结果。
5.4 使用Quantus™ Fluorometer进行荧光定量（步骤4）。
注：如果需要，最终文库可以在4°C的10 mM Tris pH 8/EB中保存长达一周，或者可以直接进行MinION测序。
三 MinION测序上机
致谢：北京金果壳公司张工和邵经理、课题组金玉和33同学。
