使用阿片类药物进行超高效合相色谱检测条件的...（二）

采用图1中所选流动相添加剂对不同色谱柱进行筛选，相关结果见图2。虽然谱图中未显示实验数据(由BEH颗粒填充的色谱柱相关数据)，但仍可发现以纯甲醇或含甲酸的甲醇作为辅助溶剂时，所有色谱柱的性能表现均较差。另外，对于所有色谱柱，其分离性能与BEH色谱柱类型，使用0.2%氢氧化铵作为添加剂与仅使用甲醇或含0.2%甲酸的甲醇相比能更好地改善峰形，而在辅助溶剂中使用甲酸和甲酸铵的复合添加剂可获得最佳的峰形、保留时间、分离度和灵敏度。图2展示了在四种色谱柱中采用图1D中所用缓冲流动相添加剂所得的色谱图。使用由2-EP颗粒填充的色谱柱进行分析时，除吗啡外，其它化合物的峰形均不可接受。使用HSS C18 SB色谱柱时，所有被测化合物的峰形均较好，但与BEH或CSH氟-苯基色谱柱相比，峰分离度较差。采用CSH氟-苯基色谱柱时，所有峰均实现基线分离，但选择性与BEH色谱柱略有不同。根据上述结果，我们决定采用BEH和CSH氟-苯基色谱柱进一步优化色谱条件。

色谱条件优化
采用已选定的缓冲添加剂(甲酸+NH4COOH)和BEH色谱柱(或CSH氟-苯基色谱柱)对剩余的化合物进行测定分析。在这些条件下，除极少数化合物外，其它所有化合物均获得的良好分离。正如所料，我们还需对混合物中的少数化合物进行额外优化。羟吗啡酮和羟考酮为其中一组化合物。这两种化合物较其它分析物具有严重的峰拖尾和峰变宽现象。两峰的色谱图见图3A。羟考酮和羟吗啡酮色谱峰在5%峰高处的峰宽分别为16.5s和22.5s，而吗啡的峰宽为4s。溶质与固定相之间的相互作用被认为会显著影响超临界条件下的保留机制^2,4。据推测，化合物与固定相之间的次级相互作用可能会导致相关化合物的峰形变差。在尝试最大程度降低任何可能的次级相互作用时，我们将辅助溶剂中添加剂的浓度增大了一倍，即0.4%甲酸和40 mM NH4COOH。上述条件的改变确实减小了这两种化合物的峰宽，结果见图3B。羟考酮和羟吗啡酮的峰宽分别减小至7.2s和9.9s，与初始条件下的峰宽相比降低了50%以上。同样重要的是，其它化合物的色谱性能未受到不利影响。

另一组测试化合物展示了许多弱极性化合物洗脱过早的色谱挑战，这些化合物示例包括哌替啶、芬太尼、美沙酮、丙氧芬和丁丙诺啡。根据上述初步筛选的相关数据，采用CSH氟-苯基和BEH色谱柱分析这些化合物非常有希望获得理想的结果；但是，在CSH氟-苯基色谱柱上使用“实验”部分中所述的最终梯度条件进行分析时，出现了分叉峰和较差的色谱结果，如图4A和4B所示。对比之下，采用BEH色谱柱所得所有化合物的峰形均较好，这可能是由于使用此色谱柱可增强分析物的保留性能或减少溶剂的影响。图4显示了在以2% 辅助溶剂为起始梯度比率的最终条件下，采用CSH氟-苯基和BEH色谱柱分析丙氧芬和丁丙诺啡的相关色谱性能。这些谱图清楚地显示采用BEH色谱柱可改善峰形，可能是由于此色谱柱能够增加分析物的保留性能。

本实验中最后一项评估的参数是样品稀释剂的选择。采用UPC²进行分析的一个优势是其与样品制备所用的溶剂兼容。无论是选择固相萃取、液-液萃取还是蛋白质沉淀，最终提取物常常溶解于可能与反相色谱条件不兼容的有机溶剂中，需对其处理才能进样分析。但是，UPC²可与多种有机溶剂兼容，省略了采用反相色谱系统时通常所需的蒸发和复溶步骤。在这些实验过程中，采用沃特世Oasis® ­Elution样品板时，通常选择甲醇、IPA和乙腈/甲醇(60:40)复合溶液稀释样品。因此，我们对这三种溶剂进行了考察。对比IPA和ACN/MeOH(60:40)稀释剂时，未观察到溶剂影响示例。仅采用甲醇作为样品稀释剂时可产生一些负面的色谱影响，如早期洗脱化合物(如芬太尼)的谱峰变宽和出现分叉。图5为采用最终方法条件所得组合色谱图。化合物的鉴定和保留时间列于表1中。其中图5A为采用BEH色谱柱所得结果，图5B为采用CSH氟-苯基色谱柱所得结果。色谱图清楚地显示：采用BEH色谱柱时，所有化合物的保留时间更长，且丙氧芬和丁丙诺啡(化合物18和16)的峰形获得改善。该方法仍可在2 min内检出所有化合物，可用于此类化合物的快速筛选。

结论
本应用资料使用一组天然和合成的阿片类药物分析来演示适用于UPC²方法开发的系统筛选策略。同时考察多种
不同化学性质的色谱柱和多种不同的辅助溶剂及添加剂可快速确定首选的初始条件，便于进一步优化。简单快
速的条件优化建立了一种可在2 min内分析19种不同阿片类药物的方法，其中所有化合物的保留时间和峰形结果均较好。另外，此方法进一步突显了UPC²用于分析种类繁多的化合物的潜在适用性。
参考文献
1. Janicot J, Caude M, et al. Separation of opium alkaloids by carbon dioxide sub- and supercritical fluid chromatography with packed columns; Application to the quantitative analysis of poppy straw extracts. Journal of Chromatography. 1988; 437: 351-364.
2. Grand-Guillaume Perrenoud A, Boccard J, et al. Analysis of basic compounds by supercritical fluid chromatography: Attempts to improve peak shape and maintain mass spectrometry compatibility. Journal of Chromatography A. 2012;1262(0): 205-213.
3. ChemAxon. Chemicalize.org. Retrieved Dec 15, 2012, from http://www.chemicalize.org/.
4. Lesellier E. Retention mechanisms in super/subcritical fluid chromatography on packed columns. Journal of Chromatography A. 2009; 1216(10): 1881-1890.