试剂、试剂盒 DEAE Sephadex* A-50(干粉）浓 NaOH透析存留物缓冲液 B

仪器、耗材 超速离心机玻璃层析柱蠕动泵、紫外（UV) 检测器、分部收集器和砌硅玻璃管

实验步骤

材料和设备

DEAE Sephadex* A-50(干粉）（Pharmacia Biotech,Inc.)

浓 NaOH(10mol/L)

透析存留物，得自实验 3

超速离心机

玻璃层析柱（直径 5 cm)

层析装置：蠕动泵、紫外（UV) 检测器、分部收集器和砌硅玻璃管（16X150 mm)

试剂

缓冲液 B(10x（临用前配制 4000 mlx 缓冲液 B，加 2-疏基乙醇至 1 mmol/L)(配方，见“试剂的配制”，PP.82—83)

操作程序

1) 用 1x 缓冲液 B 溶胀 DEAE Sephadex A-50 树脂，4°C 过夜或沸水浴 1 小时 (h)。pH8.0 下，树脂溶胀至约 30 ml/g(见文献 Ion Exchange Chromatography)，故装一根 400-ml 的柱子约需 15 g 干树脂。

2) 用浓 NaOH 将树脂悬浆的 pH 调至 8.0。树脂是以酸性形式供应的，因此需用几毫升 NaOH。不要用搅拌子搅拌，否则会把颗粒搅破。用移液管或玻璃棒手动搅拌。调好 PH 后, 静置，让树脂沉下，去上清。按此法用 1X 缓冲液 B 洗涤三次，每次洗涤后重校 pH, 直至 pH 为 8.0 并保持不变。

注：DEAE-纤维素是以游离碱的形式提供的，因此，必须用浓酸如，12 ml/LHCl) 来调节它的 pH。

3) 小心地将透析存留物从透析袋中转至烧杯。再转至 30-ml 塑料离心管中。用高速离心机 4°C、20000r/min 离心 1h。

4) 将上清倒入烧杯中。4°C 下测定样品的电导率，与 4°C 下 1X 缓冲液 B 的电导率进行比较。样品的电导率必须等于或低于缓冲液的电导率。如果太髙，加蒸馏水至与缓冲液 B 相同。尽量保持小的体积（这就是为什么要用透析而不稀释的原因记录体积。留 1% 供分析用并记录其体积。

5) 按图 1-5 所示，装填柱子，安装层析装置。如必要，更换底部的尼龙网。在柱床之上保留约 2 cm 的缓冲液，以利于梯度混合。让洗脱液经 UV 检测器流出，确保记录仪上出现基线。调节分部收集器分部收集约 10~12-ml 的组分。

6) 将蠕动泵的进液口放人装有样品的烧杯中，加样，密切注视进液口，使不要吸入空气。用 1X 缓冲液 B 洗柱，直至记录仪上的 UV 信号接近原来的基线。将流出液收集在一烧杯中。在梯度开始前不需要收集组分。

7) 梯度洗脱液的总体积为 1000 ml:500 ml1x 缓冲液 B 对 500 ml 含 0.7mol/LNaCl 的缓冲液 B。注意，lx 缓冲液 B 中已含有 0.2 ml/L 的盐，为制备 0.7mol/L NaCl，可加人 14.62 g NaCl 于 500 ml 1x 缓冲液 B 中。用一同心圆塑料梯度混合器：高盐置外腔，低盐置内腔。搅拌子置内腔，适度搅拌。

8) 按 10~12-ml 组分将全部梯度洗脱液分部收集在硼硅玻璃试管中。用 DEAE 阴离子交换层析纯化钙调蛋白的典型结果见图 1-6。