淋巴细胞培养条件选择和失败原因
一、严格无菌操作
对实验室以及培养过程中所接触的试剂、液体、器皿、仪器的消毒,均应严格按照有关细胞培养的参考书的要求进行操作。无菌观念要贯穿整个实验的始终, 不可松懈。
二、培养器皿的选择
淋巴细胞培养既可选择培养板(24 、48 、96 孔) 、培养瓶,也可选择三角烧瓶、试管等器皿进行培养。有研究表明提取的淋巴细胞用1.5ml
离心管培养72 小时,细胞生长状况良好,细胞数与培养前比较,差异无统计学意义( P >0.05)
。用青霉素小瓶进行培养,淋巴细胞生长也非常好。可以认为,对散在的细胞培养来说,用小器皿具有以下优点: (1) 便于操作:1.5ml
离心管为一次性使用,青霉素小瓶可反复刷洗,而培养板、培养瓶价格偏贵且用过几次之后,便有些模糊不清,尤其是塑料的。更为重要的是,淋巴细胞培养为悬浮培养,在培养过程中需要不断晃动,而大多数实验室没有恒温摇床。我们发现,在培养过程中每隔6～8小时晃动一次培养器皿,便可解决这个问题。青霉素小瓶、
1.5ml 离心管晃动起来相对容易些。(2) 减少污染:因为淋巴细胞培养的液体量较少,一般为100～ 200μl ,
故文献资料中多见用培养板( 48 、96孔)
,少见用培养瓶。对分散的淋巴细胞培养,一方面一次用不了那么多孔,另一方面一旦一孔有污染,其他孔便有可能被波及,使其他孔的培养也失败。而且,晃动培养板时,很容易使液体溅到培养板盖上,增加污染的机会。而使用青霉素小瓶、1.5ml
离心管等小器皿便可避免这些现象,但缺点是不易观察细胞生长,需取样加到载玻片上观察。
三、血清的选择
淋巴细胞对血清的要求较高,所以选用血清时要注意生产厂家。但胎牛血清价格昂贵,新生小牛血清或小牛血清也价格不菲,而使用自身血清不仅细胞长得好,而且更接近体内环境,避免了外来因素的干扰,使实验设计更严密。血清浓度在5
%～20 %时细胞生长比较好,当超过30 %时反而不利于细胞生长。
四、pH 值
细胞生长的最适pH 为7.0～7.2 ,可忍耐的pH 范围为6.6～7.8 ,当pH 低于6.8 或大于7.6 时, 都会抑制细胞生长 。
RPMI1640 培养基加入血清后pH 值一般升高0.2～0.4 ,故配1640 培养液及其他用液时使pH
值达到7.2比较合适,并且需经常检测pH 值。
五、培养空间
培养液与液面上的空间二者的体积比例一般以1∶10 为宜,培养液液面高度最好维持在2～5mm 的范围,以便于气体交换 。
六、恒温培养箱
温度应维持在37 ℃,CO2 浓度为5 % ,O2 为95 % ,100 %的饱和湿度。
七、常见失败原因
1.污染
污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响较小,尤其只培养72 小时。一般是分离过程中的用液和培养基出现了污染。
2.pH 值 过高或过低,或培养过程中瓶塞不紧,CO2 逸出,导致pH 值上升。
3.诱导剂 淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,在培养过程中须添加刀豆球蛋白(ConA) 、脂多糖(LPS) 、白细胞介素2 ( IL - 2) 、植物血凝素(PHA) 、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质。须注意它们的浓度及是否失效。
4.培养器皿洗涤不干净 有蜡、油污或酸残留。
5.培养用液含有杂质 配制过程中所使用的各种溶液必须用三蒸水,若含有Fe 、Ca 等离子及杂质,可影响细胞的增殖 。
6.接种的细胞数目过多或过少,或提取的淋巴细胞中混有大量红细胞 。
7.血清质量不佳。
8.恒温培养箱的CO2 、温度等不稳定。
9.存在个体差异 在相同条件下,某一受试者的血培养不成功,而对照实验培养结果正常,其原因有时无法查出.淋巴细胞的生长情况,还与受试对象的年龄有关,青年人的淋巴细胞比中、老年人的生长得要好。
