核酸探针杂交检测技术介绍
预杂交的目的是用非特异性 DNA 分子(鲑精 DNA 或小牛胸腺 DNA)及其他高分子化合物(Denhart’s溶液)将待测核酸分子中的非特异性位点封闭,以避免这些位点与探针的非特异性结合。杂交反应是使单链核酸探针与固定在膜上的待测核酸单链在一定温度和条件下进行复性反应的过程。杂交反应结束后,应进行洗膜处理以洗去非特异性杂交以及未杂交的标记探针,以避免干扰特异性杂交信号的检测。膜洗净后,将继续进行杂交信号的检测。
以放射性标记探针与固定在 NC 膜上的核酸进行杂交为例,杂交反应的操作如下。
1、配制所需试剂
SSC 溶液(20×):3mol/L NaCl,0.3mol/L 柠檬酸钠。
Denhardt’s溶液(50×):聚蔗糖5g,聚乙烯吡咯烷酮5g,牛血清白蛋白(BSA)5g,加水至500mL。
预杂交液:6×SSC,5×Denhardt’s溶液,0.5%SDS,100μg/mL 经变性或断裂成片段的鲑精 DNA。
2、操作步骤
(1)将含靶核酸的 NC 膜漂浮于6×SSC 液面,使其由下至上完全湿润,并继续浸泡2min。
(2)将湿润的 NC 膜装入塑料袋中,按0.2mL/cm2 的量加入预杂交液,尽可能挤出气泡,将袋封口,置68℃水浴1～2h 或过夜。
(3)将双链探针做变性处理使成单链,即于100℃加热5min,然后立即置冰浴使骤冷。
(4)从水浴中取出杂交袋,剪去一角,将单链探针加入,尽可能将袋内空气挤出去,重新封口,并将杂交袋装入另一个干净的袋内,封闭,以防放射性污染。
(5)将杂交袋浸入68℃水浴,温育8～16h。
(6)取出杂交袋,剪开,取出滤膜迅速浸泡于大量2×SSC 和0.5%SDS 中,室温振荡5min,勿使滤膜干燥。
(7)将 NC 膜移入盛有大量2×SSC 和0.1%SDS 溶液的容器中,室温漂洗15min。
(8)将 NC 膜移入一盛有大量0.1×SSC 和0.5%SDS 溶液的容器中,37℃漂洗30min 至1h。
(9)将 NC 膜移入一盛有新配0.1×SSC 和0.5%SDS 溶液的容器中,68℃漂洗30min 至1h。
(10)取出滤膜,用0.1×SSC 室温稍稍漂洗,然后置滤纸上吸去大部分液体,待做杂交信号的检测。
当探针是放射性标记时,杂交信号的检测通过放射自显影进行。即利用放射线在X光片上的成影作用来检测杂交信号。操作时,在暗室内将滤膜与增感屏、X 光片依序放置暗盒中,再将暗盒置-70℃条件下曝光适当时间,取出 X 光片,进行显影和定影处理。
对于非放射性标记的探针,则需将非放射性标记物与检测系统偶联,再经检测系统的显色反应来检测杂交信号。以地高辛的碱性磷酸酶检测反应为例,地高辛(Dig)是一种半抗原,杂交反应结束后,可加入碱性磷酸酶标记的抗 Dig 抗体,使其在膜上的杂交位点形成酶标抗体 Dig 复合物,再加入酶底物如氮蓝四唑盐(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸甲苯胺盐(BCIP),在酶促作用下,底物开始显蓝紫色。其基本反应程序类似ELISA,杂交信号的强弱,通过底物显色程度的深浅、有无来确定。
