聚丙烯酰氨凝胶电泳实验的原理和操作方法

设备

1、直流电源如果一次进行电泳的管数在20管以内可以用最大电流300毫安的整流器（硅或硒整流器），调压范围0-300V。

2、电泳装置包括二个缓冲液槽和电泳管。液槽可以用玻璃或塑料制成，在底部钻孔。插入电泳管，用有孔橡皮塞固定。电泳管选用孔径均匀一致的玻璃管切制。长10厘米，内径5毫米。脱色用玻璃管长10厘米，内径8毫米。底部稍拉尖，用半透膜及橡皮圈套住底部。

3、凝胶管架灌装凝胶管时使管保持垂直位置，用有机玻璃制成。

操作方法

1、凝胶管的制备将电泳玻管用小橡皮塞塞住底部，然后灌入新配的凝胶溶液。每管加至液体高度为7.5cm。为了保证凝胶表面平整可用注射器通过细针头小心地加一层（高约1厘米）蒸馏水于表面上，勿使与凝胶液混合，室温放置。如果条件合适溶液于30-60分钟内聚合而成凝胶。凝胶溶液的配制方法：溶液甲：丙烯酰胺（氯仿重结晶）25g，双体（甲醇重结晶）1g，加水配成100mL溶液。必要时用三羟甲基氨基甲烷调pH至7.0。溶液乙：二甲氨基丙腈1mL，三羟甲基氨基甲烷0.85g（也可用0.625g氨三乙醇或氨乙醇）加水至100mL。溶液丙：K3Fe(CN)6分析纯0.075g，加水至100mL新配。用作阻聚剂以延缓凝聚时间。使操作方便，如凝聚时间已足够长可以用蒸馏水代替。溶液丁：过硫酸铵（二级）2.8g加水至100mL新配。必要时用氨水调pH至7.0，溶液甲及乙配后可在冰箱中保存数月。溶液丙及丁用时新配。临用前将溶液甲、乙、丙、丁等量混合。

2、准备把已灌装凝胶的玻管通过有孔椽皮塞安装在上面液槽的底孔中，在上下两槽内分别注入缓冲液。装上后电泳管下端应浸没在下槽的缓冲液中，管下端勿留气泡。血清电泳可以用巴比妥缓冲液pH-8.6，离子强度0.05（配法：巴比妥钠10.3g，二乙基巴比土酸1.84g，加水至1L，温热使溶解加硫柳汞0.1g防霉）。

3、在血清样品中加入少量蔗糖以增加密度，用血红蛋白吸管直接小心地加在凝胶表面上，加样量一般为7μL血清。如果在样品中混入少量溴酚兰指示剂就可以在电泳过程中观察前沿移动的情况。

4、电泳在二液槽中安放铂金丝电极；正极在下，负极在上。接通电源进行电泳，电场强度10V/cm左右，视室温高低而定。室温较高时宜用较低的电压以免发热过度影响分离。蛋白质向正极移动。侍染料前沿移动至管底近处，停止电流。电泳时间为1-2小时。电泳完毕取下凝胶管，用细长针头沿管壁注蒸馏水，使凝胶与管壁剥开。然后用橡皮球压出凝胶条。

5、染色及脱色电泳后的凝胶条在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染色1小时以上。染色后的凝胶条用7%醋酸洗涤数次。置于脱色玻管中，在同一电泳装置中电解脱色。此时改用7%醋酸充装在液槽中。通电后过剩凝胶之上再加一层大孔凝胶，样品聚合在最后的另一层凝胶中。在我们的试验中省略的染料泳向正极。脱色时电场强度25V/cm，电流10-15mA/管。3-4小时脱色完毕。增高电压可以加速脱色。有色的醋酸溶液通过盛有活性炭的漏斗过滤，即可除去染料，重新使用。

6、保存与记录脱色后的凝胶可以装在盛有7%醋酸的有塞试管中保存数年。也可以自然干燥后保存，在需要观察时再浸在7%醋酸中溶胀成原来形状。记录可以用照相摄影。也可以用光密度计进行捕记。光密度计的分辨力决定于其狭缝宽窄及光电管放大倍数。

实验结果

1、电泳条件的选择

为了选择血清蛋白电泳较合适的条件，我们分别对单体浓度、双体浓度、配制凝胶时所用不同正离子、各种电压、二甲氨基丙腈的浓度、过硫酸铵的浓度等条件进行了试验。根据以上试验结果，我们在分离血清蛋白时选用的条件是：单体浓度6.25-6.5%，双体占总丙烯酰胺量的4-5%，正离子采用三羟甲基氨基甲烷，二甲氨基丙腈及过硫酸铵浓度分别为0.25%及0.7%。电泳电压以7-10V/cm较为合适。但电泳时间较长，约2-3小时，室温低时可以电压稍高。如果室温较高则可以在冰箱中进行电泳。

2、人血清及其酒精分划部分的凝胶电泳

采用上述条件我们进行了正常人血清的凝胶电泳。一般可以分成15-20条区带。根据两向电泳方法比较了纸电泳和凝胶电泳各区带的相对关系。纸电泳上的a：区带在凝胶电泳中可被分离成10条以上区带。但纸电泳中d，区带的一部分则与凝胶电泳中自蛋白区带相重合。在正常人血清中后白蛋白（PA）、转铁蛋白（Tr）和触珠蛋白（HP）均有不同的型。较纯晦白蛋白和丙种球蛋白部分，在凝胶电泳中可见明显的其他蛋白区带。

3、放射病狗血清蛋白电泳的观察

放射病动物血清蛋白的改变可以在纸电泳中观察到。一般认为狗在照射后吻球蛋白有增高。用凝胶电泳观察可以得到更深入的资料。正常狗血清的凝胶电泳图谱大致人相似。狗受致死量照射后第九天有明显变化。我们用3-10型光 谱仪用光密度计将电泳图谱进行了扫描。由于仪器的限制光缝最小只能达到0.5mm，从而影响了其分辨力。但与正常血清对比可以见到其改变的情况，这远比纸电泳中所见更为明显。

4、在分离正常人尿DNase时的凝胶电泳

观察用葡聚糖凝胶分离人尿中DNase时可以除去大部分其他蛋白质和杂质。但分离所得的制品用凝胶电泳观察还可以见到五条以上的蛋白质区带。将凝胶条在未染色前置于含大分子DNA的琼脂平板上，在37℃温箱中保温2-3小时，再用5%三氯醋酸加至如此处理过的琼脂板上，可以看到乳白色本底上出现被酶水解后的透明斑点。将凝胶条用氨黑染色后显示其蛋白区带的位置。二者比较就可以确定具有酶活性的成分的相应电泳位置。我们的试验中观察到人尿DNase在凝胶电泳中至少被分离成二条以上有酶活性的区带。说明有同功酶的可能。应用这一方法可以较深人地观察体液中酶的情况。同时也说明可以用凝胶电泳来指示生物制剂制备过程中纯化的情况。