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[分享帖]关于OD值和吸光度值最全面的整理
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最近频繁用到酶标仪，对OD值和吸光度值(abs)的概念和其线性范围不甚理解，查了很多资料，希望能供群友们参考
1、首先明白什么是朗伯比尔定律
朗伯——比尔（Lambert－beer）光吸收定律：
A＝－lgT＝εb c
A——吸光度，又称光密度“O.D”。
T——透光度， T＝I / I。， I。——为照射到吸收池上的光强，I——为透过吸收池的光强。
ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L?mol－1?cm－1）。
b——样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。
C?——样品浓度（mol/L）。
由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。
2、OD值定义
OD值(optical density)表示某一物质在某一个特定波长下的吸光度；ABS是吸光值absorbance的缩写. 在分析化学里,某一化学物质都可吸收一定波长的光,并且对光的吸收度与此化学物质的浓度成正比.因此可以利用吸光度的大小来测定某种物质的浓度.
其中某物质在特定波长下对光的吸收度,就是OD值,一般用经过石英管后的光强比上照射到石英管前的光强来表示.
3、吸光度值（abs/AU）定义
吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度 与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等。
吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关，只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。
当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。
吸光度用A表示。
A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/(g·cm),b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ， c为溶液浓度，单位g/L
影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量。此外，温度通过影响c，而影响A。
符号A，表示物质对光的吸收程度。 97801 式中I0是通过均匀的液体介质的一束平行光的入射光的强度；It是透射光强度；T是透射比。A值越大，表示物质对光的吸收越大。根据比尔定律，吸光度与吸光物质的量浓度c成正比，以A对c作图，可得到光度分析的校准曲线。在多组分体系中，如果各组分的吸光质点彼此不发生作用，那么吸光度便等于各组分吸光度之和，这一规律称吸光度的加和性。据此可以进行多组分同时测定及某些化学反应平衡常数的测定。在吸光度测定中，为抵消吸收池对入射光的吸收、反射以及溶剂、试剂等对入射光的吸收、散射等因素，可选用双光束分光光度计，并选光学性质相同、厚度相等的吸收池分别盛待测溶液和参比溶液。
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最新回复
junhun (2012-2-11 13:36:43)
"Optical density" can also refer to index of refraction.
In spectroscopy, the absorbance A (also called optical density) is defined as: Aλ=log10(I0/I)
where I is the intensity of light at a specified wavelength λ that has passed through a sample (transmitted light intensity) and I0 is the intensity of the light before it enters the sample or incident light intensity (or power). Absorbance measurements are often carried out in analytical chemistry, since the absorbance of a sample is proportional to the thickness of the sample and the concentration of the absorbing species in the sample, in contrast to the transmittance I / I0 of a sample, which varies logarithmically with thickness and concentration.
Absorbance vs transmittance
Absorbance
Transmittance (I / I0)
Percent transmittance (100 * I / I0)
0 1 100
0.1 0.79 79
0.25 0.56 56
0.5 0.32 32
0.75 0.18 18
0.9 0.13 13
1 0.1 10
2 0.01 1
3 0.001 0.1
Instrument measurement range
Any real measuring instrument has a limited range over which it can accurately measure absorbance. An instrument must be calibrated and checked against known standards if the readings are to be trusted. Many instruments will become non-linear (fail to follow the Beer-Lambert law) starting at approximately 2 AU (~1% Transmission). It is also difficult to accurately measure very small absorbance values (below 10?4) with commercially available instruments for chemical analysis. In such cases, laser-based absorption techniques can be used, since they have demonstrated detection limits that supersede those obtained by conventional non-laser-based instruments by many orders of magnitude (detections have been demonstrated all the way down to 5 10?13). The theoretical best accuracy for most commercially available non-laser-based instruments is in the range near 1 AU. The path length or concentration should then, when possible, be adjusted to achieve readings near this range.
junhun (2012-2-11 13:37:04)
OD值
1. 朗伯——比尔（Lambert－beer）光吸收定律：
A＝－lgT＝εb c
A——吸光度，又称光密度“O.D”。
T——透光度， T＝I / I。， I。——为照射到吸收池上的光强，I——为透过吸收池的光强。
ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L?mol－1?cm－1）。
b——样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。
C?——样品浓度（mol/L）。
由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。
2. DNA和RNA的OD值
2.1 原理
嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值（图3-25），在230nm处为吸收低谷，其吸光率（absorbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处，对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1μg／mL的核酸水溶液在260nm处的吸光率，天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020，变性DNA和RNA的比吸光系数为0.022。据朗波－比尔光吸收定律A＝-lgT＝εbc知，c＝A/εb，而b通常为1cm，所以，通常以1OD值相当于50μg／mL双螺旋DNA，或40μg／mL单螺旋DNA（或RNA），或20μg／mL寡核苷酸计算。
2.2 纯度
DNA和RNA的纯度可以通过测定260nm，230nm和280nm的紫外吸收值来测定，纯的DNA OD260／280在1.8-1.9，OD260／230应大于2.0，纯的RNA OD260／280在1.9-2.0，如果DNA比值高于1.8-1.9，可能有RNA没有去除干净，如果DNA比值小于1.8-1.9，可能含有酚或者蛋白质（RNA中含有酚或者蛋白质比值也会降低），若OD260／230小于2.0说明有残存的盐或小分子杂质污染。
2.3 浓度
DNA和RNA的量，据朗波－比尔光吸收定律A＝-lgT＝εbc知测量样品的浓度为c＝A/εb，又知ε＝0.020，在b＝1cm的情况下，c＝A/（0.020×1）＝50×A，则未稀释的样品的浓度为50×A×稀释倍数（μg／mL）＝50×A×稀释倍数/1000（mg／mL）
2.4 注意事项：
1) 比色杯应为石英杯，玻璃杯在此波长时读数不准。
2) 检测时应使OD260值在 0.15 到1.0之间，数值比较准确。
3) 这种比值测定的方法仅仅适用于核酸浓度大于0.25ul／ml的时候，浓度小于0.25ul／ml的时候测量误差较大。
4) 既含有RNA又含有蛋白质也可能使比值维持在1.8，这个时候要根据电泳情况鉴定是不是含有RNA，或者测定一下是不是含有蛋白质；
5) A260/A280比值可提供DNA纯度的一个参考，但A260/A280 比值会受pH影响。如果未调pH，比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值，建议在10 mM Tris Cl, pH 8.5中检测，此时纯净的DNA A260/A280比值应为1.8-2.0（注意应使用同样缓冲液作为对照）。
6) 进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。
7) 可以在220-330 nm 之间进行扫描，此扫描可以检测是否有其它因素影响OD260，如在325 nm 处有吸光值说明有污染物或比色皿不干净。)
8) DNA的量与260 nm处的吸光度值（OD值）成正比，在引物设计时，1个OD值的合成DNA的重量约为33 mg。
junhun (2012-2-11 13:37:31)
计数吧，呵呵
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酶标仪也是紫外光谱，紫外的有效测定范围0.1~1.0，超出此范围后虽然可以显示值，但是不是呈线性了，就不准确了。
测MTT时如果值超出1，就应该稀释，用原来的溶剂稀释即可。
OD是optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里出现的专有名词 一般人理解较困难 具体检测涉及到很多物理等方面知识 你只须知道是阴性即可
光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。
检测单位用OD值表示， OD是optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度， OD＝1og（1／trans），其中trans为检测物的透光值。
吸光度
吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度 与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等
吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。
当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。
吸光度用A表示。
A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/(g?cm),b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ， c为溶液浓度，单位g/L
影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量。此外，温度通过影响c，而影响A。
1 污染细菌可导致OD过高。 细胞过多一般会减小方差，而不会增大之。因为细胞长满后，生长速度会减小，包括肿瘤细胞。
如果OD太大，可吸出一半溶剂，再加入相同体积溶剂，重测。以减小OD值。
2 每组的6个数，删除2个离群值（可以是最大值和最小值，也可以是2个最大或2个最小值），只统计4个。
3 血清不影响MTT实验。但我对HT-29不清楚。
4 请参考文献中关于HT-29的MTT实验方法。
junhun (2012-2-11 13:37:52)
BUK (2012-2-11 13:38:26)
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Linearity (Photometry)
0 to 4 Abs, (96-well plate) at 450nm, ±2%
0 to 3 Abs (384-well plate) at 450nm, ±2%
Accuracy (Photometry)
±2% or 0.003 Abs, whichever is greater, at 200 to 399nm (0 to 2 Abs)
±1% or 0.003 Abs, whichever is greater, at 400 to 1000nm (0 to 3 Abs)
Precision (Photometry)
SD <0.001 Abs or CV <0.5%, whichever is greater, at 450nm (0 to 3 Abs)
注意这里只是在波长为450nm和96孔板的情况下，0~4Abs才满足线性关系，而且偏差在±2%对于某些试验误差已经非常大。
junhun (2012-2-11 13:39:09)
0 to 4 Abs, (96-well plate) at 450nm, ±2%
0 to 3 Abs (384-well plate) at 450nm, ±2%
Accuracy (Photometry)
±2% or 0.003 Abs, whichever is greater, at 200 to 399nm (0 to 2 Abs)
±1% or 0.003 Abs, whichever is greater, at 400 to 1000nm (0 to 3 Abs)
Precision (Photometry)
SD <0.001 Abs or CV <0.5%, whichever is greater, at 450nm (0 to 3 Abs)
注意这里只是在波长为450nm和96孔板的情况下，0~4Abs才满足线性关系，而且偏差在±2%对于某些试验误差已经非常大。
您说的是正确的！
kewanqi2011 (2012-2-11 13:39:28)
帖子很经典，顶。我有一个疑惑，我现在做MTT，在540nm和570nm的波长下测得同一物质的吸光度完全不一样，570的值是0.000几了，而540的是0.1几，为什么为相差那么多
cocacola (2012-2-11 13:39:52)
wmp1234 (2012-2-11 13:40:20)
楼主，想请问一下，我们实验样品的OD值比空白对照组的值还要低，做出标准曲线后，使得样品浓度成为负值了，什么原因呢？
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