石蜡切片和半薄切片的制作

2019.4.20

实验概要

本方法介绍了石蜡切片和半薄切片的制作流程。

主要试剂

4%戊二醛固定液(pH7.0磷酸缓冲液)，乙醇，二甲苯，纯石蜡，蜂蜡，树脂胶

主要设备

真空泵，AO手摇式切片机，Olypmus BH-2型显微镜，LKB超薄切片机

实验步骤

1. 石蜡切片的制作

1) 取材固定

新鲜配置4%戊二醛固定液(pH7.0磷酸缓冲液)，选取材料，立即投入固定液中用真空泵抽气，以加快固定液渗透，更换一次固定液，放置过夜。

2) 脱水、透明、浸蜡、包理

a. 固定好的材料经70%、80%、90%、95%、100%、100%无水乙醇分别脱水1h；

b. 用二甲苯置换材料中的乙醇，具体方法是：100%无水乙醇、50%乙醇-50%二甲苯、100%二甲苯、100%二甲苯，每级各1h；

c. 浸蜡、包埋的具体方法如下：50%二甲苯-50%石蜡过夜，纯石蜡24h，纯石蜡24h，纯石蜡 10%蜂蜡12h，包埋成石蜡块；

d. 用AO手摇式切片机进行切片，厚度为7-8um；

e. 42℃展片，烘干。

3) Toludine Blue O(TB O)染色

将带材料的载玻片按以下步骤进行脱蜡、染色、封片。

二甲苯20min，二甲苯20min，50%二甲苯-50%无水乙醇5min，无水乙醇5min，无水乙醇5min， 100%、100%、95%、90%、80%、70%、50%、30%、10%梯度乙醇复水，每级2min，蒸馏水5min，1%TBO染色10s，自来水冲洗20min，蒸馏水5min，经10%、30%、50%、60%、70%、80%、 90%、95%、100%、100%梯度乙醇脱水，100%无水乙醇5min，100%无水乙醇5min，二甲苯5min，树脂胶封片。

制得的石蜡切片用Olypmus BH-2型显微镜观察与照相。

2. 半薄切片的制作

1) 取材

将新鲜的植物叶片切成0.5cmX0.5cm的小片，避开主叶脉部分，立即投入到新配置的3.5%戊二醛固定液中，用真空泵抽气，以加快固定液渗透，放置过夜。用0.1M pH 7.2的磷酸缓冲液冲洗2h，更换6次，再用1%的饿酸固定4h；

2) 脱水、包理

用浓度梯度为45%、55%、70%、85%、95%、100% I、100% II的乙醇脱水，环氧丙烷过度2次，Epon812树脂浸透、包埋、聚合；

3) 切片、展片

用LKB超薄切片机将包埋好的材料切成厚度为1.5-2.0um的薄片，置于一滴水中将薄片展开，之后吸干多余水分，烘干；

4) 染色、观察

将烘干的薄片用亚甲基蓝染色，显微镜观察拍照。

切片

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