| 实验步骤 |
一、材料
1. 缓冲液与溶液
氯仿
10 X 去磷酸化缓冲液（CIP 缓冲液）
乙醇
苯酚: 氯仿（1:1, V/V)
SM
醋酸钠（3 mol/L, pH 5.2)
TE ( pH 8.0)
2. 酶与缓冲液
T4 噬菌体 DNA 连接酶
牛小肠碱性磷酸酶（CIP)
限制性内切核酸酶：Bam HⅠ，MboⅠ，XbaⅠ
只切割黏粒载体而不切割基因组插入 DNA 的限制性内切核酸酶
3. 凝胶
0.5 X TBE 配制的 0.7% 琼脂糖凝胶，其中含有 0.5 μg/ml 的 EB
0.5 X TBE 配制的 0.8% 琼脂糖凝胶，其中含有 0.5 μg/ml 的 EB
脉冲场凝胶（或 0.5% 琼脂糖凝胶）
4. 培养基
TB 琼脂平板（含 25 μg/ml 卡那霉素）
TB 培养基
TB 培养基（含 25 μg/ml 卡那霉素)
5. 核酸与寡核苷酸
对照 DNA: 用 HindⅢ 消化的 λ 噬菌体 DNA
对照 DNA: 超螺旋 SupeiCos - 1DNA
高分子质量基因组 DNA
置于 1X 去磷酸化缓冲液中的线状质粒标记
DNA: 线状 λ 噬菌体 DNA
6. 专用设备
预设至 16℃ 与 65℃ 的水浴
7. 载体与菌株
λ 噬菌体包装混合物
λ 噬菌体贮存液
适宜于测定被包装黏粒滴度的大肠杆菌平板菌株（如 XL1-Blue、ED8767、 NM554, DH5αMCR)
SuperCos - 1 DNA (Stratagene)
二、方法
SuperCos - 1 DNA 的线状化与去磷酸化
1. 将 20 μg SuperCos - 1 DNA 与 50 单位的 XbaⅠ 在 200 μl 1 X XbaⅠ 消化缓冲液中混合，37℃ 温育 2~3 h。
2.
温育 2 h 后，将约 1 μl 反应液转移到另一新管中。通过 0.8% 琼脂糖凝胶分析该管中黏粒 DNA。并使用下述对照：① 50~100
ng 超螺旋 SuperCos- 1DNA；② 经 HindⅢ 消化的 50~100 ng λ 噬菌体 DNA。
3. 分别用酚: 氯仿和氯仿抽提消化物一次。
4. 转移水相至一新离心管中，经标准乙醇沉淀，70% 乙醇洗涤后，回收线状黏粒 DNA。打开离心管盖，倒置放于纸中上，让乙醇挥发殆尽, 然后用 180 μl H2O 溶解湿润 的 DNA 沉淀。从中吸取 100 ng 的 DNA 溶液用作对照。
5.
加入 20 μl 10X 去磷酸化缓冲液至剩余的 DNA 溶液中，再加入 0.1 单位 CIP。37℃ 下温育反应混合物 30
min。然后将反应体系置于预设 65℃ 的水浴中温育 30 min 使 CIP 失活。移出两份 100 ng 的 DNA 液体用作对照。
6. 用酚: 氯仿和氯仿分别抽提反应混合物一次。经标准乙醇沉淀，70% 乙醇洗涤后，回收线状去磷酸化的 SuperCos-1 DNA。将湿润的 DNA 沉淀溶解在 180 μl H2O 中。
黏粒臂的分离
7. 转移 50~100 ng 去磷酸化的 DNA 溶液至一新离心管，冰浴保存。在剩佘的去磷酸化 DNA 中加入 20 μl 10x BamHl 限制缓冲液及 40 单位的 BamHⅠ，37℃ 温育 2~3 h。
8.
温育 2 h 后，再转移 1 份 DNA 溶液至另一微量离心管。用琼脂糖凝胶电泳分析两份 DNA 样品。经 BamH I 消化，线状 7.9
kb 大小的去磷酸化 SuperCos-1 DNA 片段应被大量切割成约 1.1 kb 和 6.8 kb 的两种 DNA 片段。
9. 用酚: 氯仿和氯仿分别抽提反应混合物一次。经标准乙醇沉淀，70% 乙醇洗涤后，溶解湿润的 DNA 沉淀于 20 μl H2O 中，4℃ 保存备用。
高分子质量基因组 DNA 的部分消化
10. 建立用 Mbo I 部分消化 30 ng 高分子质量基因组 DNA 样品的反应条件，目的是产生最大量的大小为 38~52 kb 的 DNA 片段。
消化反应的进程可通过脉冲电场凝胶电泳
( PFGE) 或 0.5% 琼脂糖凝胶电泳（效果较差）来鉴定，同时采用以下标记物：① 单位长度的 λ 噬菌体 DNA 和（或）② 连接于
cos 位点的 λ 噬菌体 DNA 多聚体，这些多聚体经仅切割线状 λ DNA 一次的限制酶部分消化。0.5%
的琼脂糖凝胶非常稀薄，灌胶及电泳最好在 4℃ 下进行，并采用低电压（1~2 V/cm) 长时间（15~24 h) 电泳。
当只有少量基因组
DNA 可利用时（如利用流动分选的染色体或凝胶纯化的 YAC DNA 构建文库时)，部分消化的条件可建立在小规模的反应体系中，该体系含有
50~100 ng 基因组 DNA 和不同量 ( 0.0005 ~0.001 单位）的限制酶。消化 15 min 后，取 10~20 ng
的小份反应物用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和 Southern 印迹来分析，Southern 印迹所用探针与被检测 DNA 有重复序列。
11.
根据步骤 10 中所建立的部分消化条件，建立三个大规模的反应体系，每个含有 100 μg 的高分子质量基因组 DNA 和步骤 10
确定的最佳浓度的 MboI。温育结束后，从每一部分消化的 DNA 中取出小量通过琼脂糖凝胶电泳鉴定分子大小，方法同步骤 10 中注释。
12. 合并经部分消化获得的含有最大量 38 - 52 kb 大小基因组 DNA 片段的两部分样品。 用酚: 氯仿和氯仿分别抽提合并后的 DNA 一次。乙醇沉淀，70% 乙醇洗涤一次。用 180 μl TE （pH 8.0) 溶解湿润的 DNA 沉淀。
高分子质量基因组 DNA 的去磷酸化
13. 向上述重悬的部分消化的基因组 DNA 中加入 20 μl 10 x 去磷酸化缓冲液和 20 单位 CIP。迅速抽取少量 DNA 样品用作对照。
(1) 移取一小份含有 0.1~1.0 μg DNA 反应物至一个小的微量离心管（0.5 ml) 中， 该管中事先加有含 0.3 μg 线状质粒的 1X 去磷酸化缓冲液（如经 Bam HI 切割的 pUC)。
(2) 将 0.3 μg 同样的线状质粒加入 10 μl 1x 去磷酸化缓冲液中为另一对照。
此对照中不加入 CIP。
(3) 继续步骤 14~16 操作。
14. 37℃ 温育大规模的去磷酸化反应物和两个对照样品 30 min, 然后移至预设 65℃ 的水浴中，温育 30 min 使 CIP 失活。
15. 冷却反应物至室温，用酚:氯仿和氯仿各抽提一次。乙醇沉淀，70% 乙醇洗涤一次, 回收 DNA。
如果在去磷酸化反应中只有少量基因组 DNA (<1 μg)，在漂浮滤膜上将抽提的 DNA 用 TE ( pH 8.0)进行透析。
16. 用 10 μl 1X 连接反应缓冲液溶解两对照 DNA。在每管中加入 0.1 Weiss 单位的 T4 噬菌体 DNA 连接酶，并于室温温育 3 h, 琼脂糖凝胶电泳鉴定连接的 DNA 产物。
在含有基因组 DNA 与质粒 DNA 的对照样品中，由于它们经过磷酸酶处理，不应出现连接迹象，而未经处理的质粒 DNA 应转化为多聚体或闭环分子。
17. 用少量体积的水 4℃ 过夜溶解大规模反应体系中的 DNA, 目的是使其终浓度达到约 500 μg DNA/ml。可通过琼脂糖凝胶电泳估测 DNA 浓度，最好测定 A260。
黏粒臂与基因组 DNA 的连接：包装反应与重组子的铺平板
18. 建立一系列连接反应体系（终体积 20 μl), 包括：
黏粒臂 DNA 2 μg，去磷酸化的基因组 DNA 0.5,1.0 或 2.5 μg，10 X 连接反应缓冲液 2 μl，T4 噬菌体 DNA 连接酶 2 Weiss单位，16℃ 温育连接反应物 12~16 h。
当使用的载体的两个 cos 位点由产生平末端的限制酶切割而分离时，连接反应缓冲液中应补充 ATP 至终浓度为 5 mmol/L, 从而抑制平末端的连接（Feiretti and Sgaramella 1981), 进而抑制栽体多联体的形成。
19. 使用商品化的包装反应试剂盒时，按照供应商推荐的条件，取 5 μl 各连接反应物包装入 λ 噬菌体顆粒（相当于 0.5 μg 载体臂)。包装反应结束后，向反应物中加入 500 μl SM 和 20 μl 氯仿，将稀释液 4℃ 保存。
可克隆于黏粒中插入片段的大小受制备包装提取物所采用方法的影响（Bates
and Swift
1983)。在理想情况下，用于包装黏粒的提取物应该用含亚精胺而不是腐胺的缓冲液制备。当包装提取物和包装反应中去除腐胺时，该系统显示对被包装的
DNA 分子大小的选择性。因此，当 DNA 长度为野生型体 DNA 80% 时， 其包装效率为野生型 λ 菌体的
1/200。在块乏腐胺的情况下，含有较大插入片段（约 45 kb) 的黏粒被优先包装，由于尚未知晓的原因，也可能是由于缺乏 ter
功能，一些适合于 λ 菌体 DNA 的包装提取物并不适合包装黏粒。一些商品化包装提取物，如 Stratagene 的 Gigapack Ⅲ
XL, 比其他提取物更适合于黏粒文库的构建。
20.
转导适宜的大肠杆菌宿主菌，以测定每份包装反应物中包装黏粒的滴度。从每份反应物中取出一小份稀释 100 倍后，取 0.1 ml 与 0.1 ml
SM 和 0.1 ml 新鲜平板接种菌混匀。将被感染的培养物在 37℃ 下温育 20 min, 以使含有重组黏粒的噬菌体颗粒吸附。加入 1 ml
TB, 37℃ 继续温育 45 min, 使 SuperCos-1 载体中的卡那霉素抗性基因得到表达。
21. 取 0.5 ml 和 0.1 ml 细菌培养物涂布于含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 琼脂平板上。于 37℃ 温育过夜，然后计算细菌菌落数。
22. 挑取 12 个单个菌落，在含 25 μg/ml 的 TB 中进行小规模（2.5 ml ) 培养，时间不超过 6~8 h。培养过程中剧烈振荡。
重组黏粒的分离与分析：文库的有效性
23. 从上述 12 个小规模细菌培养物中各取 1.5 ml, 用碱裂解的方法分离黏粒 DNA。
24. 取 2~4 μl 每一份制备的 DNA, 用只切割黏粒载体而不切割克隆的基因组 DNA 的插入片段的限制酶（如 NotⅠ与 SatⅠ) 消化，再经 0.7% 的琼脂糖凝胶电泳分析消化片段的大小。
25. 计算携带插入片段的菌落比例。
26. 通过分离一些克隆，并用脉冲场凝胶电泳鉴定插入片段的大小来估计插入片段的平均长度。
27. 计算文库的“库容量”，即含有多少基因组当量。
如果文库的大小与质量都令人满意，可铺平板并通过杂交来筛选文库, 或者扩增与贮存文库。
如果文库构建中遇到困难，应尝试找出实验中最可能引起失败的原因。例如，高比例的“空载"克隆可能提示载体 DNA 去磷酸化不完全；如果重组子过少，提示在连接反应中的基因组 DNA 或黏粒臂的数量不足，也可能是串联体包装进入 λ 噬菌体颗粒的效率低。
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