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CCK-8法缺点

2020.5.12

  Cell Counting Kit-8(简称CCK8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。相信做细胞的童鞋们对他都很熟悉,然鹅,你确定你使用CCK-8试剂的方式是完全正确的吗?我们还是来仔细了解下吧:

  一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理

  WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】属于MTT的升级产品,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的颜色的深浅与活细胞的数量成正比,因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析,使用酶标仪在450mM波长处测定OD值,间接反映活细胞数量。

   用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验。

  CCK-8的优点:

  使用方便快捷,省去了洗涤细胞,不需要放射性同位素和有机溶剂;

  CCK-8法的检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度;

  CCK-8法的重复性优于MTT法;

  CCK-8法对细胞毒性小;

  CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,毋需预制,即开即用。

  CCK-8的缺点:

  与MTT法相比,CCK-8和XTT的价格比较贵。

  CCK-8试剂的颜色为淡红色,与含酚红的培养基颜色接近,不注意的话容易产生漏加或多加。

  CCK-8与以往的增殖/毒性测定试剂相比较:

1.jpg

  二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法

  实验一:细胞增殖分析

  1、制备细胞悬液:细胞计数

  2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。

  3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。

  4、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基,以换液的形式加入。

  5、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。

  6、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。

  实验二:细胞毒性分析

  1、制备细胞悬液:细胞计数

  2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。

  3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。

  4、加入不同浓度的毒性物质

  5、37℃培养箱中培养:加入毒性物质的培养时间,要看毒性物质的性质和细胞的敏感性,一般要根据细胞周期来决定,起码要一代以上的时间。

  6、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。

  7、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。

  8、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。

   注:

  若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。

  如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK8之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

  三.CCK8检测细胞增殖/毒性的注意事项和常见问题归纳

  注意事项:

  1.酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰,可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

  2.CCK8可以检测大肠杆菌,但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染,以免影响结果。

  3.当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。

  4.在培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时,还应考虑药物的吸收,可在加入药物的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度作为空白对照。

  5.金属对CCK8显色有影响:当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话,将会100%抑制。

  6.悬浮细胞由于染色比较困难,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。

  常见问题归纳:

  1:CCK的保存和稳定性如何?

  答:CCK稳定性高,避光条件-20℃有效期2年,4℃有效期1年。经常使用建议4℃保存,避免反复冻融。CCK正常颜色为粉红色,若颜色发生明显偏差,质量可能有发生变化。

  2:CCK的细胞毒性如何?

  答:CCK毒性非常低,因此CCK检测完后相同的细胞还能用于其它细胞增殖检测如结晶紫染色法,中性红染色法或DNA荧光染色法。

  3:CCK会对活细胞进行染色吗?

  答:不会,首先WST-8不会进入细胞染色,整个显色反应都是在培养体系中进行的。另外WST和WST-8甲臜都属于高度水溶性组分,反应结束更换新的培养液,即可清除外源组分。

  4:做细胞活性检测时,每孔应该接种多少个细胞?

  答:当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100 μL培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100 μL培养基)。

  5:在加入CCK-8时可否不更换培养基?

  答:一般情况下可以不更换培养基。但是如果培养基里有氧化还原性物质的话,有可能会产生误差,必须更换其它培养基。

  6:若是使用6孔或者24孔板进行试验,CCK试剂使用量怎么样呢?

  答:如果要使用6孔板或24孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK溶液。

  7:能否用384孔板进行细胞增殖与活性检测的实验呢?

  答:可以,CCK-8产品的使用量为每孔培养基总体积的10%。建议先将CCK-8产品稀释一倍,然后加入培养基总体积的20%即可,这样可减少误差。

  8:只可以在450 nm波长处测OD值吗?

  答:可以在450 nm波长处测OD值,但是若无此波长的滤光片,可选择吸光度在430-490 nm之间的滤光片,但是450 nm滤光片的检测灵敏度最高。

  9:若是暂不检测OD值,该如何处理?

  答:若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化

  10:在实验中OD值太高,怎么解决?

  答:可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如:可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。此外,可适当减少细胞的数量。

  11:如果OD值太低,怎么解决?

  答:可以采取2个办法:1、适当增加细胞数量 2、延长加入CCK-8试剂后的反应时间。

  12:应该每次做标准曲线吗?

  答:建议每次做。虽然细胞是一样的,但是细胞的状态不一定一样。对于状态不一样的细胞,建议每次做标准曲线。


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