盐析萃取蛋白质分配行为研究

盐析萃取是利用物质在有机溶剂与盐构成的互不相溶的两相中的溶解度不同而实现分离的方法,已用于多种蛋白质分离,如脂肪酶,重组人血清白蛋白,免疫球蛋白G,淀粉酶,纤维素酶等,其对蛋白质结构、活性具有良好的保护作用,且收率及除杂效果较好。除此之外,盐析萃取特有的分相快,易操作,高效率,低毒性,易回收,低成本,易与其他分离技术偶联的优点,使其具有良好的工业大规模生产应用前景。目前,盐析萃取蛋白质的研究处于对特定蛋白的具体分离条件探索中,其规律性研究尚未开展。本文通过考察多种蛋白在不同盐析萃取条件中的分配情况,对盐析萃取分离蛋白进行了规律性归纳总结,并在此基础上,开展了盐析萃取偶联柱层析分离人血浆蛋白的研究。 首先,研究了盐与有机溶剂种类,pH, NaCl等因素对盐析萃取自然体系成相的影响。乙醇盐析萃取体系中,五种盐成相范围比较：柠檬酸钾硫酸铵碳酸钾磷酸氢二钾碳酸钠；磷酸氢二钾盐析萃取体系中,六种醇成相范围比较：甲醇乙醇异丙醇正丙醇叔丁醇仲丁醇；pH降低,盐析体系成相范围缩小；NaCl的添加显著缩减了乙醇/柠檬酸钾和乙醇/磷酸氢二钾盐析萃取体系相图的盐浓度范围。 其次,研究了盐与有机溶剂种类,系线长度,pH, NaCl等因素对白蛋白在盐析萃取体系中分配行为的影响,研究了11种蛋白本身疏水性与分子量对其分配行为的影响及分相时间影响因素。随盐离子强度增加,体系的盐析作用增强,白蛋白由下相向上相分配,随有机溶剂极性减小而由上相向下相分配；各类盐析萃取体系中,系线越短,靠近临界点体系,对蛋白萃取效果较好；添加3%NaCl的乙醇/磷酸氢二钾体系显著提高白蛋白收率；蛋白质疏水性对其分配行为影响较大,疏水性越大,蛋白易于向下相分配,亲水性蛋白受有机溶剂极性影响明显。盐析萃取下相为连续相时,分相时间较短,且分相时间随蛋白含量增加而增长,有机溶剂极性减小而减小。 最后,采用pH7,17.5%乙醇/20%磷酸氢二钾盐析萃取体系偶联柱层析分离血浆蛋白。盐析萃取过程中HSA与IgG的收率分别为97.7%,95.4%1疏水层析时,能够一步得到纯度为98.56%(HPLC检测)的人血清白蛋白；对于IgG与白蛋白的疏水层析的混合峰,采用HipTrap QFF离子交换层析可制备纯IgG和白蛋白,电泳分析显示单带,其中,HSA纯度大于99.28%, IgG与HSA的收率分别为92%,88%。