粗糙脉胞菌顺序四分子分析实验
实验方法原理
粗糙脉胞菌的菌株具有两种不同的接合型(matingtype),用A、a或mt+、mt-表示。接合型是由一对等位基因控制的,并符合孟德尔分离定律。不同接合型菌株的细胞接合后可以进行有性生殖。在有性生殖过程中,不同接合型的菌丝相接触,两核配对,但不融合,形成双核体,随着双核体菌丝的发育,子囊壳中形成很多伸长的囊状孢子囊,即子囊进行发育。在这些尚未成熟的子囊中即含有融合以后形成的二倍体合子。合子形成以后就很快在发育的子囊中进行减数分裂,形成4个孢子,再进行一次有丝分裂,形成8个单倍体的子囊孢子,而整个子囊壳就成为成熟的子囊果(图21-1)
粗糙脉胞菌的子囊孢子是单倍体,即它们是减数分裂的产物,由它萌发长出的菌丝也是单倍体。所以一对等位基因决定的性状在杂交子代中就可以看到分离。在粗糙脉胞菌中,一次减数分裂产物包含在一个子囊中,所以从一个子囊中的子囊孢子的性状特征就很容易直观地看到一次减数分裂所产生的四分体中一对等位基因的分离。而且8个子囊孢子是顺序排列在狭长形的子囊中,根据这一特征可以进行着丝粒作图,并发现基因转换(geneconversion)。如果两个亲代菌株有某一遗传性状的差异,那么杂交所形成的每一子囊,必定有4个子囊孢子属于一种类型,4个子囊孢子属于另一种类型,其分离比为1∶1,且子囊孢子按一定顺序排列。如果这一对等位基因与子囊孢子的颜色或形状有关,那么在显微镜下可以直接观察到子囊孢子的不同排列方式(图21-2)。
实验材料 粗糙脉胞菌野生型菌株：Lys + 接合型 A 分生孢子呈粉红色粗糙脉胞菌赖氨酸缺陷型菌株：Lys - 接合型 a 分生孢子呈白色。
试剂、试剂盒 基本培养基 补充培养基 完全培养基 杂交培养基 3% 来苏尔
仪器、耗材 显微镜 恒温培养箱 镊子 载玻片 试管及培养皿
实验步骤
1. 杂交接种:将亲本菌株接种在同一杂交培养基上。先接缺陷型,后接野生型,一次在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝。然后在培养基上放入一灭菌的折叠滤纸,在试管上贴上标签,注明亲本、杂交日期及实验者姓名。
2. 培养:将试管放入25℃温箱进行培养。5～7d后就能看到许多棕色原子囊果出现,随后逐渐发育成熟,变大变黑,约21d(3周),就可在显微镜下观察。需要注意的是,赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较迟,当野生型的子囊孢子已成熟变黑时,缺陷型的子囊孢子还呈灰色,因而我们能在显微镜下直接观察不同的子囊类型。如果观察时间选择不当就不能观察到好的结果。观察时间过早,孢子都未成熟,全为灰色;过迟都成熟了,全为黑色,都不能分清子囊类型。所以最好在子囊果发育至成熟大小,子囊壳开始变黑时,每日取几个子囊果压片观察,到合适时期置于4～5℃冰箱条件下,保证在3～4周内观察就行。
3. 压片观察:将附有子囊果的滤纸条放入3%来苏尔溶液10min,杀死孢子,以防止污染实验室。取一载玻片,滴1～2滴3%来苏尔溶液,然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上,盖上另一载玻片,用手指压片,将子囊果压破,置显微镜低倍镜下观察,即可见一个子囊果中会散出30～40个子囊。观察子囊孢子的排列情况。这里用载玻片盖上压片而不用盖玻片,是因为子囊果很硬,盖玻片易破裂。此过程不需无菌操作,但要注意不能使分生孢子散出,以致不能分辨子囊类型。观察过的载玻片,用过的镊子和解剖针等物都需放入来苏尔溶液中浸泡后取出洗净,以防止污染实验室。
