荧光墨水／染料碳酸氢铵2-巯基乙醇SDS载体蛋白（溶于去离子水中）三氯乙酸（TCA）乙醇过氧化氢甲酸TPCK-处理的胰蛋白酶（溶于去离子水／ HCl ）电泳缓冲液绿色标记染料层析缓冲液

单边剃刀刀片／手术刀片闪烁计数器1.7 ml 微量离心管一次性的组织研磨件摇床台式离心机纤维素薄层色谱板小体积可调移液器由韧性塑料制成的一次性长吸头带滤器的空气管HTLE 7000 电泳装置聚乙烯膜电泳芯子层析缸风扇65℃ 烘箱

实验试剂仪器的具体要求和准备见「其他」。

1. 用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离含有 ³²P 标记的蛋白质样品。

2. 电泳后，干胶，四周边缘用荧光墨水标记，对 X 射线胶片曝光（放射自显影）。

3. 通过与胶片上的凝胶四周荧光标记的位置的比对确定蛋白质的位置。将胶片与干胶钉在一起，胶片朝下放入一个光盒里。在胶的背面用软铅笔或圆珠笔（不要用标签笔）标记出 32P 标记蛋白质条带的位置。

4. 将干胶与胶片分离开，用单边剃刀刀片从胶上割下蛋白质条带。从割下的胶条上剥去纸片并用刀片轻轻刮去残留的纸屑。尽量不要削掉凝胶，因为这会减少蛋白质的回收。将胶条放到 1.7 ml 带螺旋盖的微量离心管中，用闪烁计数器进行契仑科夫计数以测定放射量。

5. 将干的胶条重新浸入 500 μl 50 mmol/L 碳酸氢铵，pH 7.3～7.6 中，于室温下放置 5 min。用 Kontes 组织研磨杵捣碎胶条，直至管子对着光看不到胶块时为止。加入 500 μl 50 mmol/L 碳酸氢铵，pH 7.3～7.6，10 μl 2-巯基乙醇和 10～20% SDS，煮 2～3 min。

6. 在摇床上于室温下摇荡 4 h 或于 37℃ 至少摇荡至少 90 min 以提取蛋白质。

7. 用带吊桶式转子的台式离心机于室温下 500 g 离心 5 min 收集管底的凝胶浆。上清移至新的 1.5 ml 微量离心管中。

8. 在开始第二次洗脱前，测量第一次洗脱液的体积并计算出第二次洗脱的液体量，以使两次洗脱液合并在一起的总量约为 1300 μl。第二次洗涤时，按计算出的量加入 50 mmol/L 碳酸氢铵，内含 0.1% SDS 和 1.0% 2-巯基乙醇。涡旋振荡，煮 2～3 min，然后在摇床上孵育至少 90 min 进行再次提取。

9. 按照步骤 7 的方法离心分离凝胶和洗脱液，将上清液转移到装有初次洗脱液的管子中。

10. 为了除尽合并的洗脱液中的凝胶浆，全速离心 5～10 min，将上清液转移到新的管子中。在丢弃凝胶碎片前，用契仑科夫计数法进行检测以确保有 60%～90% 的 ³²P 标记蛋白被回收。

11. 将洗脱液放置在冰上冷却。加入 20 μg 载体蛋白（10 μl 2 mg/ml 的储液），充分混匀，加入 250 μl 冰冷的 100% TCA，充分混匀，冰上孵育 1 h。

12. 于 4℃ 全速离心 5～10 min 收集蛋白质沉淀。弃上清液，再次于 4℃ 离心 3 min，去除残留的 TCA。

13. 加入 500 μl 冰冷的 96% 乙醇颠倒管子几次洗涤 TCA 沉淀，于 4℃ 全速离心 5 min，弃上清液，再次于 4℃ 离心 3 min，去除残留液体。晾干蛋白质沉淀（不要冻干）。

14. 用契仑科夫计数法对沉淀进行检测以确保大部分的 ³²P 标记蛋白被回收。

此时样品的 cpm 值应当与洗脱液（见步骤 10）的 cpm 值相同或稍微高一些，因为洗脱液的液体会碎灭减少计数。

15. 制备过甲酸：将 9 份甲酸与 1 份 30% 过氧化氢混合，于室温下孵育 60 min。将过甲酸放置于冰上冷却。

16. 将 TCA 沉淀的蛋白质重悬于 50 μl 冰冷的过甲酸中，冰上孵育 60 min。

17. 加入 400 μl 去离子水，混匀，放置于干冰上冷冻。在 SpeedVac 蒸发器中真空蒸发掉过甲酸。

18. 将蛋白质沉淀重溶于 50 μl 50 mmol/L 碳酸氢铵，pH 8.0, 加入 10 μg 胰蛋白酶（10 μl 1 mg/ml 的储液）， 37℃ 消化 3～4 h 或过夜。

19. 再加入 10 μg 胰蛋白酶，再次于 37℃ 消化 3～4 h 或过夜。

20. 加入 400 μl 去离子水，在 SpeedVac 蒸发器中冻干。将干粉重溶于 400 μl 去离子水中并再次冻干。如此重复，至少要冻干 4 次。

21. 将胰蛋白酶消化的产物重溶于 400 ul 电泳缓冲液或去离子水中。

22. 全速离心 5～10 min 去除肽混合溶液中的颗粒物质，将上清液转移到一个新的微量离心管中，冻干。用契仑科夫计数法测量最终样品的 ³²P 放射量。

23. 用至少 5 μl 的 pH 1.9 的电泳缓冲液、pH 4.72 的电泳缓冲液或去离子水，重新溶解消化产物，全速离心 2～5 min 收集管底的样品溶液。

24. 用超软的钝头铅笔在 TLC 平板的纤维素侧划小叉标记出样品和染料起始点（图 17.9.1），注意不要扰动纤维素层（或者也可以选择在反面用记号笔做标记）。

25. 用装有长而柔韧吸头（圆的，凝胶上样吸头很好用）的小体积可调移液器，将各个样品（1000 cpm）点到相应的起始点上。每滴点 0.2 ～0.5 μl，吹干后再点下一滴，可以用带滤器（滤掉浮质及颗粒物质）的气管和 1 ml 注射器或巴斯德吸管吹干所点的样品。

26. 在板的顶端的染料起始点上滴加 0.5 μl 绿色标记液（图 17.9.1 和图 17.9.2）。

27. 如下准备 HTLE 7000 装置，参见图 17.9.3。

27.1 将电泳缓冲液倒入缓冲液缸中，约 5 cm 深。在 Teflon 盖子上放一张聚乙烯膜以保护并隔绝底座，膜的两端折下塞入底座和缓冲液缸之间，将膜固定。

27.2 在电泳缓冲液中浸湿电泳芯子，将芯子的一边塞入缓冲液缸中，折起另一边放在底座上的聚乙烯膜上。再取一张聚乙烯膜放于底座、电泳芯子和部分缓冲液缸上。

27.3 在顶上放第二张 Teflon 膜和氯丁橡胶垫，封闭装置，用两个销子固定盖子。将气压调至 10 psi 使气袋膨胀以从电泳芯子中挤出多余的缓冲液。保持气压直到开始电泳为止。

27.4 当样品点到 TLC 平板（步骤 25 和 26）并准备开始电泳时，关闭气压并打开装置。除去氯丁橡胶垫和顶端的 Teflon 膜及聚乙烯膜，折回电泳芯子。用绵纸擦干两张聚乙烯膜。

27.5 按照图 17.9.2 浸湿含有样品的 TLC 平板并将之放于覆盖底座的聚乙烯膜上。将两侧的电泳芯子分别盖在平板的边上约 1 cm 宽，然后按照上述操作小心地重新搭好装置。聚乙烯膜与 TLC 板接触后，要避免其侧移。用销子固定盖子，使气袋膨胀至 10 psi , 打开冷却水流，开始电泳。

27.6 以 1.0 kV 电压电泳 20～30 min，在一维方向上分离肽（图 17.9.2）。

28. 电泳完成后，拆除装置，用风扇吹干 TLC 平板，至少吹 30 min。

29. 在平板的左手边或右手边的边缘与样品起始点齐平的位置点上一滴（约 0.5 ml） 绿色标记染料，避免滴加到被电泳芯子接触挤压过的区域（图 17.9.4）。将干的平板近乎竖直地放置到装有合适的层析缓冲液的层析缸中，盖上盖子。在层析进行时切勿扰动层析缸或打开盖子。使缓冲液跑到距离平板顶端 1～2 cm 处。

30. 打开层析缸，将 TLC 平板从层析缸中取出。使平板在通风橱中干燥 1 h 或在 65℃ 烘箱中干燥 15 min。

31. 用荧光墨水在平板四周做标记，这些参照标记有助于以后的放射自显影图片与TLC 平板的比对。在增感屏的辅助下将平板对 X 射线胶片或磷屏曝光以进行放射自显影。如果需要回收肽以备进一步的分析的话，参见辅助方案。

1. 特别注意：管子的品牌非常重要。应当选用不会产生副作用或在最后转移一步中吸附太多 cpm 的管子。作者使用的是 Myriad Industries 的微量离心管。

2. 步骤 17 中，非常重要的一点是稀释并冷冻后再进行蒸发，否则，SpeedVac 蒸发器中温度的升高会使样品酸水解。
这时可以取一份样品（5%～10% 的消化物，至少 200 cpm）进行磷酸氨基酸分析。进行冻干和后续操作。

3. 步骤 22 中，非常重要的一点是最终的样品溶液中不能有颗粒物质存在，为了确保这一点可以重复几次这一步的离心操作。

4. 步骤 26，标记染料呈绿色，但在电泳时能分离出蓝色（二甲苯蓝 FF）和黄色（edinitrophenyllysine）的成分（图 17.9.2D）。

5. 在步骤 27.5，作者利用起始点周围带孔的吸水纸来使电泳缓冲液浸湿 TLC 平板以尽量使样品集中（图 17.9.1 和图 17.9.2）。吸水纸是由两层 Whatman 3 MM 滤纸沿着边缘缝合在一起做成的。用锋利的软木塞打孔器在围绕起始点的位置（图17.9.1）打出 1.5 cm 的孔。最好每种 缓冲液分别用各自的吸水纸。

6. 缓冲液必须以相近的速度，从周围移向起始点。如果缓冲液需较长时间才浸润到点样点，或不均衡地经过点样点，那样品点不可避免地会形成条纹状。

7. 步骤 30 中，如果还需要将肽从平板中提取出来以备进一步分析之用的话，不要使用烘箱进行干燥。

试剂：

荧光墨水或染料（可以从大部分工艺美术商店购得）

50 mmol/L 碳酸氢铵，pH 7.3~7.6 （新鲜配制的缓冲液 pH 大致为 7.5），和 pH 8.0 （放过夜后 pH 会变为约 8.０，这对步骤 18 中的胰蛋白酶消化或胰凝乳蛋白酶消化比较理想）

2-巯基乙醇

20%（m/V）SDS

50 mmol/L 碳酸氢铵，pH 7.3~7.6，含 0.1% （m/V） SDS 和 1.0%（V/V）2-巯基乙醇

2 mg/ml 载体蛋白（RNase A，BSA 或免疫球蛋白）溶于去离子水中（分成等份储存于 -20℃ 或 -70℃）

100% （m/V） 三氯乙酸（TCA）

96% 冰冷乙醇

30% （m/V） 过氧化氢

98% （m/V） 甲酸

1 mg/ml TPCK-处理的胰蛋白酶（如 Worthington） 溶于去离子水或 0.1 mmol/L HCl （分成等份储存于 -70℃ 或液氮中）

电泳缓冲液：pH 1.9、35、4.72、6.5 和 8.9

绿色标记染料

层析缓冲液

仪器：

单边剃刀刀片或手术刀片

适用于契仑科夫计数法（Cerenkov counting）的闪烁计数器

1.7 ml 带螺旋盖的微量离心管（Sarstedt）

一次性的组织研磨件（Kontes）

摇床

具有吊桶式转子的台式离心机

20 cm × 20 cm ×100 μm 纤维素薄层色谱板（EM Sciences）

小体积可调移液器，由韧性塑料制成的一次性长吸头，如凝胶上样吸头

带滤器的空气管，能滤掉气溶胶和颗粒物质

HTLE 7000 电泳装置（CBS Scientific）

聚乙烯膜 （35 cm × 25 cm； CBS Scientific）

电泳芯子（20 cm × 28 cm Whatman 3MM 滤纸，对折成双层厚度的 20 cm × 14 cm的纸片）

层析缸（CBS Scientific）

风扇，用于吹干 TLC 平板

65℃ 烘箱