生物芯片技术在药物R&D中的应用（二）

4 建立病原作基因的表达模型
　　由于病原体的基因组规模相对较小，可用包含其全部基因的DNA 芯片鉴定那些对人产生毒害作用的基因。异烟肼（isoniazid，INH）是治疗肺结核的常用药物，其治疗结核病的机制是它阻断了分枝茵酸的生物合成途径。Wilson等根据已测序的肺结核杆菌基因组序列，用PCR方法扩增了3834个ORF（占全部 ORF的97％），固化在玻片上，制成检测肺结核杆菌基因表达的DNA芯片。用INH处理敏感菌株，发现除了生化途径已清楚的与分枝菌酸合成相关的一些基因转录水平发生变化外，还发现EfpA基因的表达也被诱导发生了变化，推测EfpA基因也参与了分枝菌酸的生物合成，而EfpA基因只在分枝菌属中一些致病的种类中才存在，故EfpA基因可以作为治疗结核病的新靶点。另外，分别用INH和 Ethionamide处理敏感菌株，获得了相似的基因表达谱，证实了两者具有相同的作用机制。

5 研究药物处理细胞后基因未达变化
　　药物与细胞（特别是敏感细胞）相互作用，将引起细胞外部形态及内部正常代谢过程的一系列变化。其内部生理活动的变化可集中表现在其基因表达的变化上。通过测定分析药物对细胞的基因表达的影响，可推测药物的作用机制，评价药物活性及毒性，进而确证药物靶点或者发现新的药物靶点。通过DNA芯片测定药物诱导的细胞基因表达变化来进行药物筛选与研究，对那些用常规方法很难追踪监测的药物或需要很长时间才能得到药物临床实验结果时，显得尤为有用。
　　通过监测阳性药物处理前后组织细胞基因表达变化情况可以获得许多十分有价值的信息。首先，经药物处理后表达明显改变的基因往往与发病过程及药物作用途径密切相关，很可能是药物作用的靶点或继发事件，可作为进一步药物筛选的靶点或对已有的靶点进行验证；其次，药物处理后基因表达的改变对药物作用机制研究有一定的提示作用。
　　理论上讲，药物作用诱导的细胞基因表达变化应与缺失编码该药物作用靶点的基因引起的基因表达变化相似。Marton等使用含有6065个酿酒酵母的ORF的DNA芯片检测发现，由免疫抑制剂 FK506诱导的的基因表达变化在缺失编码被 FK506抑制的蛋白的基因变种中未观察到，但在缺失与FK506作用无关的基因变种中却视察到了。于是推测FK506除了与亲免蛋白（immunophilins）结合外还有其他被忽略的作用靶（off－target）。在实验基础上，他们提出了所谓的解码器战略（decoder strategy），即首先比较经过药物作用的野生株和缺失某些基因的变种株的基因表达谱，若二者相似，则将这种变种挑选出来，并将其与药物作用。如果突变基因所编码的蛋白质参与的生物途径受药物的影响，则药物诱导该变种的基因表达变化与药物诱导野生株基因表达变化将不同。用这种策略不仅可以确证药物作用靶，还可以发现未曾引起人们注意的作用靶，并可从这些被忽略掉的靶中推测药物的毒副作用。Cyclin依赖型激酶（cyclin－dependent kinas es，CDKs）在细胞增殖中有着重要的作用，是一种抗肿瘤药物的靶点。Gray等从2，6，9，-三取代嘌呤化合物库中筛选CDKs的抑制剂。他们将体外有活性的2种化合物flavopiridol和52（化合物代号）与酵母作用，然后用共含有260000个长度为25个碱基的一组寡聚核苷酸芯片检测酵母基因表达变化。试验结果表明，几乎所有的已知与细胞周期相关的基因表达下调。虽然flavopiridol和52体外活性相似，但他们引起的酵母基因表达的变化却有显著的差异，表明二者对酵母的作用途径是不一样的。
　　鬼臼亚乙苷（etoposide）是p53活化拓扑异构酶 Ⅱ的抑制剂，在临床上作为一种抗肿瘤药物。Wang 等经用鬼臼亚已苷作用人成骨肉瘤细胞系U2－ OS后，根据不同的时间间隔分别提取细胞mRNA，用寡核苷酸芯片测定6591条mRNA表达百的变化，发现62条mRNA表达县有变化。通过选取其中12条基因做进一步研究，发现有2条是已知的 p53调控基因（WAF1／p21和PCNA），有两条是新的p53靶基因，其余的与p53无关。在实验基础上，他们提出了介导鬼臼亚乙苷诱导细胞凋亡的信号传导途径。此项研究工作使人们又多获得一种抗肿痛药物的靶点。
　　应用DNA芯片还可直接筛选特定的基因文库以寻找药物的作用靶点。如给酵母某一特定的呈单倍体状态的基因对应的位置上放置一个遗传标记，该标记可被DNA芯片所识别，那么通过比较药物作用前后用芯片检测整个文库的结果，便有可能获得药物作用的靶基因。研究者称此种筛选方式为 haploinsufficiency drug screen。
　　用DNA微阵列芯片进行药物研究还存在如下一些缺点：①由于杂交样品制备复杂，采用DNA微阵列芯片很难实现高通量。②DNA微阵列芯片只能用于检测已知序列的基因。③由于灵敏度的限制，采用现存的DNA微阵列芯片难以检测到表达水平很低的基因。
　　除了DNA芯片外，组织芯片、蛋白质芯片和细胞芯片也在药物研究中崭露头角。最近，耶鲁大学的研究小组首次报道了真核生物蛋白质组水平的蛋白质微阵列芯片。他们表达和纯化了酵母的 5800种蛋白质，并将这些蛋白质点样固定在载玻片上，制作了酵母蛋白质组微阵列芯片。他们使用这种芯片筛选能与特定蛋白质和磷脂相互作用蛋白质，发现了新的能与钙调蛋白和磷脂相互作用的蛋白质。这种蛋白质微阵列芯片可以用于筛选与蛋白质相互作用的药物，还可以用于检测蛋白质翻译后的修饰。他们的研究成果证实了制作和使用蛋白质组微阵列芯片进行功能分析检测的可行性，并向人们预示了蛋白质微阵列芯片在药物开发领域的广阔应用前景。
Zlauddin和Sabatinl发明了一种细胞微阵列芯片。他们首先将不同的质粒DNA点在玻璃片上，做成质粒DNA做阵列芯片。接着用脂质转染试剂处理该质粒DNA微阵列芯片，然后在处理好的质粒DNA微阵列上培养哺乳动物细胞。点在芯片上的质粒DNA在转染试剂的帮助下原位转染哺乳动物细胞，在质粒DNA微阵列的每一个质粒样品点的相同位置形成了转染了该质粒的细胞群。细胞因获得了外源DNA而获得了新的性状。这样，由质粒DNA芯片制成了由不同性状细胞组成的细胞做阵列芯片。他们尝试用这种细胞芯片来确证药物作用靶点，寻找能改变细胞生理状态的基因产物。这种新型细胞芯片可以用来在哺乳动物细胞内高通量筛选有可能成为候选先导分子的化合物、蛋白质或寡核苷酸。在功能基因组研究和药物开发等领域具有很大的应用潜力。