实验方法原理

光谱染色体核型分析（SKY)采用24种颜色对所有染色体进行涂染，在一次试验中可以观察到每一条染色体。该技术以光谱成像和傅里叶光谱学原理为基础。对流式分选的染色体进行PCR标记，直接标记荧光素或间接标记半抗原。5种光谱学不同的纯色染料进行组合得到独特的染色体探针混合物。探针混合物与中期染色体杂交，用高级的图像分析方法进行检测。

实验材料 组织样本

试剂、试剂盒 37℃预热的1X胰酶柠檬酸盐甲醇：冰乙酸=3:1(V:V)1×PBS20×SSC

仪器、耗材 37℃温箱或水浴锅15mL锥形底离心管

实验步骤

一、探针

已经标记好的商品探针以混合形式溶解在杂交液中。

二、从组织中制备染色体

1.在组织培养用的超净工作台中进行无菌操作，在无菌培养皿中，用刀片将组织切碎成细小的块。

2.将细碎的组织块转入有足够培养基的、具有通气孔的组织培养瓶中；培养基要盖过平面放置的培养瓶底（通常10〜15mL)。

3.将培养瓶放入CO2培养箱中，静置培养24h。

4.光镜下观察其生长状态。

5.当达到要求的生长状态或培养时间时，向培养瓶中加入秋水仙胺至终浓度10μg/mL，在CO2培养箱中继续培养2〜3h。

6.将培养基和悬浮的组织或细胞一起转移到15mL锥形底离心管。对于非贴壁细胞，继续步骤10。

7.向培养瓶中加入10mL柠檬酸盐溶液，漂洗贴壁的细胞，弃去柠檬酸盐溶液。

8.向培养瓶中加入10mL 1×胰酶。观察贴壁细胞自培养瓶壁上脱离，轻轻吹打，将细胞自瓶壁上吹打下来，转移到15mL锥形离心管中。

9.向含有贴壁细胞的15mL锥形离心管内加入5mL新鲜配置的培基

10.1500g离心10min收集细胞。

11.倒掉或吸出上清，只留下0.5〜1mL溶液。用手指轻轻敲打管底，打散细胞团。

12.加人预热的0.075mol/L KCl溶液，开始的1mL逐滴加入，滴加中间混匀;然后将剩下的14mL加入并轻轻颠倒混匀，37℃放置10min。

13.加入5滴比例为3:1的甲醇：冰乙酸，混匀。

14.1500g离心10min。

15.倒掉或吸出上清，打散细胞团。加入新鲜配置的甲醇：冰乙酸（3:1)固定液15mL，用上述的方法开始的1mL逐滴加入，滴加中间混匀；然后加入剩余的14mL固定液，并轻轻颠倒混匀。

16.1500g，离心.10min。

17.重复步骤15的固定。然而，最初的1mL不需要逐滴加人。离心，重复固定3次。

18.细胞悬液可以以固定液中细胞团的状态-20℃保存。

19.为了进行染色体标本制备，倒掉固定液，重悬细胞团块，加入适量的新鲜固定液使悬液轻度浑浊。

20.用200μL的枪，吸取100μL悬液，滴到干净的载玻片上，室温下晾干并储存片子。滴好的片子至少自然老化2d或37℃过夜老化。