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外泌体研究深度剖析

2020.9.05

　　一申请国自然没保障，外泌体来助攻

　　2018年国自然申请马上就要展开，科研界一年一度的压轴大戏又要上演。中了国自然，新的一年安安心心搞科研，舒舒服服过大年；没有中，那可能意味着接下来又是紧衣缩食的一年。在这里云序小编先衷心的祝福各位老师2018新年快乐，开春申请的基金都能中，所有的实验都成功，想发的文章都能发，身体健康，万事如意，阖家幸福！今天小编除了送祝福，也带来了一份新春“贺礼”——国自然最新研究热点，外泌体研究思路。掌握了这个热点，小编相信各位老师国自然申请之路必然会一帆风顺。

　　首先我们对历年的国自然及pubmed收录外泌体相关研究进行统计，看看它是否名副其实。下图统计了近三年外泌体研究成果，文章数量一直居高不下，国内外泌体研究起步较晚，国自然立项呈起步之势，从趋势来看，外泌体国自然立项必将持续走高。

　　目前，外泌体研究与高通量测序联系最为紧密，一般认为外泌体起到主要功能是细胞之间的通讯官，那外泌体所包裹转运的RNA、蛋白质等信息挖掘变得极为重要。同样，外泌体中既含有编码RNA，也含有非编码RNA，课题设计也可根据分子类型不同而不同，下图罗列了2017年外泌体基金立项，其中囊括了外泌体-miRNA、LncRNA及环状RNA等热门分子领域。并且基金资助类型十分全面，从资助金额巨大的重点项目，到鼓励青年学者的青年基金，每一层面都可以看到外泌体的踪影。

　　还需值得注意的是，越来越多的研究者将外泌体与转化医学联系起来，特别是液体活检方向，相信假以时日，外泌体必然为疾病的诊断与治疗带来重大改革。

　　在文章发表方面，国内学者陆续发表的外泌体高分文章，进一步引燃该领域研究热情。来自二军大的王林辉研究团队在去年4月份发表了一篇Cancer Cell（IF = 27.407）文章，证明lncRNA与肾癌靶向药物耐药有关，并且细胞间主要通过外泌体传播这种肿瘤耐药相关分子。去年年末，南京医科大学刘起展团队在Cancer letters（IF = 6.375）上发表了关于外泌体miRNA促进亚硝酸盐引发的肿瘤炎症反应相关研究结果。可喜可贺，新年伊始，云序生物天津医科大学总医院客户在Journal of Neurotrauma（IF=5.190）最新发表小鼠脑组织外泌体环状RNA测序文章，为国内外泌体研究学者在添一项硕果。光说不练是假把式，接下来让我们一起看看外泌体究竟是什么，研究思路又具体是怎样呢？

　　二外泌体研究思路大揭秘

　　传说中的外泌体（Exosomes）顾名思义就是细胞“吐”出来的东西，广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液中。它结构上类似一个极小的气球（圆形单层膜），至于有多小，大概等同于一个病毒的大小（30-100nm）。这个小东西之所以会引起大家普遍关注，主要是因为它很会“藏宝”—外泌体中不仅包含蛋白质成分，还包括一些RNA成分，如miRNA、lncRNA、mRNA和circRNA等。外泌体所携带的这些RNA统称为外泌体来源RNA，具有完整的序列结构和生物活性。目前发现外泌体来源RNA与肿瘤细胞转移等过程密切相关，也被认为极有潜力成为下一代液体活检新型分子标志物。下面小编介绍的几篇文章都是依托高通量技术手段揭示外泌体RNA在机体疾病过程中所发挥的重要作用。

　　案例1：脂肪组织巨噬细胞分泌外泌体miRNA可大幅改善体内胰岛素敏感性

　　外泌体中包含多种miRNA，调控靶细胞生理活性。近日，Cell（IF：30.410）发表文章，发现脂肪组织巨噬细胞（adipose tissue macrophages，ATMs）分泌的外泌体中含有miRNA并可以转移到胰岛素的靶细胞中，从而调节靶细胞对胰岛素的敏感性以及体内的总糖代谢稳态。Olefsky团队从肥胖小鼠脂肪组织内分离出巨噬细胞，再收集细胞里的外泌体，用它们处理体型瘦的健康小鼠，发现接受了外源外泌体的小鼠虽然体重依然正常，但却出现肥胖诱导型胰岛素抵抗症状。相反，提取瘦小鼠来源的脂肪组织巨噬细胞外泌体，并用它在肥胖小鼠上治疗，会大幅改善体内和体外的葡萄糖耐受和胰岛素敏感性。最后，研究人员证明miR-155是肥胖个体脂肪组织巨噬细胞外泌体差异表达的miRNA之一，miR-155极有可能直接通过抑制其靶基因PPARγ来抑制胰岛素信号传导和葡萄糖耐受。

　　原文：Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity

　　案例2：外泌体lncRNA促进肾癌肿瘤细胞耐药性

　　肿瘤学顶级期刊Cancer Cell（IF：27.409）发表文章，阐述了疾病相关lncRNA参与肾癌耐药性及通过外泌体传播的生理机制，将外泌体lncRNA的研究又一次带到了大众视野中。首先作者通过高通量手段检测了野生型细胞和耐药型细胞中差异表达的lncRNA，并通过病人源性异种移植模型(PDX)鉴定到8条疑似致病lncRNA。将其中一条lncRNA-lncARSR (Activated in RCC with Sunitinib Resistance)敲除后，细胞耐药性显著增强。进一步研究表明lncARSR与肾癌细胞增殖、粘附等表型密切相关。作者研究发现，lncARSR主要存在于细胞外泌体中，并且耐药细胞外泌体lncRNA含量要远高于野生型细胞。作者随后通过RNA Pull Down实验证实核不均一性核糖核蛋白A2B1(hnRNPA2B1)负责包埋lncARSR进入外泌体。当提取耐药细胞外泌体孵育到野生型细胞后，野生型细胞胞内lncARSR含量增加，细胞耐药性增强。而胞内lncARSR主要发挥miRNA海绵功能，通过竞争性结合miRNA-34和miRNA-449，促进AXL和c-MET表达及下游STAT3、AKT、ERK信号通路的活化，最终导致舒尼替尼耐药性形成。

　　原文：Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA

　　案例3:大脑创伤小鼠脑组织来源外泌体环状RNA表达

　　大脑创伤（TBI）具有极高的发病率和致死率，不同程度危害身体健康，目前对其致病机理，尤其是对神经系统造成伤害的分子机制尚不知晓。已知外泌体中富含环状RNA，一类新发现的环形非编码RNA，多数以miRNA海绵机制调控下游功能基因的表达。近日，Journal of Neurotrauma（IF=5.190）发表文章，研究了大脑创伤小鼠模型脑组织来源外泌体环状RNA的表达图谱，并对其功能进行了预测。作者首先分离小鼠脑组织，提取脑周质外泌体，依托二代高通量测序技术手段，进行了外泌体全转录组测序。作者共发现231个差异表达的环状RNA，155个上调，76个下调。通过GO及KEGG分析对其中外泌体环状RNA进行了功能预测。GO分析表明这些RNA分子主要参与神经损伤修复，神经系统发育及神经信号传导相关，这些分子同时主要富集在cGMP-PKG信号通路。CircRNA-miRNA互作网络图揭示了环状RNA作用靶miRNA及可能的功能。本文首次研究了大脑创伤外泌体中环状RNA变化，为后续分子机理详细研究提供诸多靶分子。

　　原文：Circular RNA expression alteration in exosomes from the brain extracellular space after traumatic brain injury in mice

　　针对上述优秀的研究文章，小编进行了一番总结，梳理了几条外泌体研究思路，希望可以给各位老师一些帮助。首先，从大范围来看，外泌体研究也可以分为三大思路，表达谱、分子标志物及分子机制方向。这三类研究均依托高通量测序揭示外泌体携带RNA分子对细胞功能造成影响。机制方向比较特殊，一种思路是直接研究差异外泌体RNA对细胞造成影响及分子功能；而另一种思路是将外泌体与研究细胞共培养后，对共培养及单独培养细胞进行测序，从而找到外泌体具体作用目的细胞靶基因。

　　三云序生物外泌体研究最优选

　　云序生物外泌体服务总流程

　　云序生物提供外泌体一站式服务流程，客户只需提供样品（血清、血浆、体液、细胞上清等），云序生物完成从外泌体抽提到后续测序分析所有服务。后续我们不仅为客户提供海量数据，更为客户甄别有效数据，提供出版级别经典图片。

　　云序生物外泌体提取服务

　　云序生物外泌体抽提均采用成熟商业试剂盒（Qiagen）抽提，在保证抽提外泌体质量及外泌体RNA浓度的情况下，最大程度保证提取样品均一性。云序生物针对不同客户需求有两类外泌体抽提服务方案。

　　一步法：一步到位，从血清、血浆、尿液、细胞上清等样品中直接抽提外泌体RNA。该方法省去单独提取外泌体的步骤，可以最大程度节省样本，得到高丰度RNA，满足测序要求。

　　两步法：该方法先从样本中富集外泌体，可进行外泌体鉴定等服务；之后再从外泌体中提取RNA进行测序，该方法样本损失较大，但可对富集的外泌体进行鉴定。

　　电镜鉴定

　　外泌体在电镜下具有非常明显单层膜结构，30-100nm大小不一的茶托样结构（通常为茶托型或一侧凹陷的半球形）。

　　外泌体Western Blot鉴定

　　外泌体表面CD63、 CD9、TSG101 标记通过 western blot鉴定。

　　云序生物外泌体高通量筛选服务